DOI:10.1126/sciadv.aax5785
1月29日，香港浸会大学任康宁和清华大学戈钧研究团队合作在Science Advances发表文章Defect-induced Activity Enhancement of Enzyme-Embedded Metal-Organic Frameworks Revealed in Microfluidic Gradient Mixing Synthesis，报道了基于微通道混合制备具有高催化活性的酶-金属有机骨架晶体复合物的新方法。该研究发现，在微通道中，基于层流状态下形成的浓度梯度混合方式合成的复合物颗粒具有显著的配位缺陷，从而产生大量介孔，有利于底物和包埋酶的传质接触，大幅提高了固定化酶催化剂的表观活性，同时保持了固定化酶良好的稳定性和可重复使用的优点。高催化活性和良好稳定性是酶催化剂在药物合成、医疗诊断、生物医药等很多领域应用的关键。将酶分子包埋于无机晶体中，利用载体微环境的限域效应可以显著提高酶催化剂在人工应用环境下的稳定性，是基于化学工程和纳米技术手段改造酶催化剂的高效途径。但是，常规无机晶体酶固定化材料（例如金属有机骨架晶体）具有很小的孔径结构，导致酶催化反应过程中底物扩散受限，难以与包埋于晶体中的酶分子高效接触，从而降低了酶催化剂的表观活性；而降低底物扩散阻力的尝试，又往往在合成步骤伤害酶的活性或损失酶固定化的牢固程度，使得活性和稳定性难以兼得。如何改造酶固定化材料的结构使其提高酶稳定性的同时保持高活性成为一大挑战。微流控科技为解决这一难题提供了新思路和独特手段。该研究发现，不同于溶液中一步共沉淀合成酶-金属有机骨架晶体复合物的过程，在微通道中，层流状态下反应物分子自由扩散形成的浓度梯度使得每个酶-金属有机骨架晶体复合物颗粒在形成过程中经历了显著的浓度扰动，导致大量的配位缺陷而形成介孔结构（见图1）。
图1 基于微流体通道内层流梯度混合产生的晶体缺陷效应提高酶催化剂表观活性示意图。在微通道中，由于反应物浓度梯度变化产生配位缺陷，生成含有介孔的酶-MOF复合物（A），而在常规溶液反应下形成的酶-MOF复合物为微孔结构（B）。研究中通过扫描电镜、透射电镜、X射线衍射、X射线吸收精细结构谱、BET孔径分析、反应-扩散模型模拟计算等手段相结合，对比了微流控层流合成与常规溶液中一步共沉淀法合成酶-金属有机骨架晶体复合物的结构差异。反应-扩散模型模拟计算结果显示在微通道中的层流扩散混合方式会形成浓度梯度，导致每个载体颗粒在形成过程中经历随时间不断变化的配体-金属离子浓度比（图2A, B）。X射线衍射发现此条件下形成的复合物也具有接近常规溶液中一步共沉淀法合成的酶-金属有机骨架晶体复合物的衍射峰，但存在结晶度低及峰位偏移现象，说明可能形成了含缺陷的晶体; 氮气吸附实验确认了复合物中存在直径3-6 nm的介孔，而相应的传统晶态复合物中仅存在1 nm左右的微孔；X射线吸收精细结构谱说明相比于晶态金属有机骨架复合物，层流扩散中合成的载体材料中存在配位缺陷。这些分析表征证明了载体中由于锌离子的配位缺失导致了材料中介孔结构的出现。通过载体中的酶催化反应-扩散模型的理论计算，该研究发现晶态复合物中1 nm左右的微孔限制了酶的底物分子在载体中的传质，从而严重降低了酶催化剂的表观活性，而微流控层流合成的酶-金属有机骨架复合物中，大量3-6 nm的介孔有利于底物分子的传质。在活性对比测试中，微流控层流合成的酶催化剂的表观活性比传统溶液法合成提高5~20倍，接近于天然状态酶的活性（图2C）。对照实验也证明单纯选择层流梯度混合浓度变化范围内的某个浓度进行常规一步共沉淀法合成并不能提高活性。同时，微流控层流合成的载体与传统晶态载体相似，通过限域包埋显著提高了酶催化剂在高温、蛋白酶等苛刻条件下的稳定性。因为微流控层流合成形成介孔的过程是自发的，并不需要借助模版和置换溶剂等过程，包埋反应温和不伤害酶活性，从而成为兼得活性和稳定性的创新思路。图2 微通道中基于层流的浓度梯度混合方式产生连续变化的2-甲基咪唑和锌离子摩尔比（A），尤其在第一种混合方式下（B中Scheme 1），其摩尔比先急剧增大，后逐渐降低，由此形成的MOF晶体中包含大量配位缺陷，产生介孔结构，酶催化剂表观活性显著高于常规方法合成的产物（C）。该研究工作创新性的将微流体的独特物理特性应用到酶固定化合成反应，观察到了显著不同于常规方法的产物特性，通过系统研究证实在此反应条件下产物自发包含介孔结构，并深入分析了其产生机理及对酶催化剂表观活性的影响。该研究表明这种梯度动态混合模式有望成为一种重要的固定化酶合成新方法，通过自动产生介孔的温和反应过程在保证稳定性的同时，极大提高了酶催化剂的活性，解决了当前工程化改造酶催化剂研究中难以兼顾活性和稳定性的难题，为酶催化剂工程改造提供了新思路。同时，利用微流控梯度动态混合引发产物晶体结构缺陷，可能为精确改造纳米结构/材料提供了新理论基础，有望作为一种通用方法合成具有新特性的纳米材料。该工作同时也拓展了微流控技术在纳米材料、生物化学等领域的应用。胡冲博士（香港浸会大学、江西科技师范大学）和白云岫（清华大学）为本文共同第一作者，香港浸会大学助理教授任康宁，清华大学化工系长聘副教授戈钧为本文共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划纳米科技重点专项青年项目、国家自然科学基金优秀青年基金、北京市自然科学基金杰出青年基金等项目的资助。
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