分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Expanding the Genetic Code with Lysine Aminoacylation”，通讯作者是来自美国阿肯色大学的Chenguang Fan教授，他的研究方向聚焦于开发非天然氨基酸整合系统用于蛋白质翻译后修饰和相互作用研究。这篇文章中，作者应用遗传密码子拓展策略，建立了十种不同赖氨酸氨基酰化的正交翻译系统。

赖氨酸氨基酰化修饰是一种新兴的蛋白质翻译后修饰，其底物蛋白广泛参与各种生物过程。然而由于在特定位点产生氨基酰化的工具有限，目前仍然缺乏针对这一修饰的功能研究。因此作者希望应用遗传密码子拓展策略，开发形成赖氨酸氨基酰化的正交翻译系统，用于研究氨基酰化对代谢酶功能的影响。

作者首先测试了野生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）对20种氨基酰化赖氨酸的识别能力，发现其仅能识别苏氨酰化赖氨酸和半胱氨酰化赖氨酸。为了获得识别更多类型修饰的PylRS，作者基于PylRS共晶结构，选取与吡咯啉环相互作用的Y271、L274、C313三个位点构建随机突变文库，成功筛选出识别10种氨基酰化赖氨酸的突变体。进一步，作者将筛选得到的突变位点移植至优化嵌合体骨架，并引入增强效率的辅助突变，使十种修饰的掺入效率提升了2-4倍。质谱验证表明，目标蛋白在特定位点的修饰纯度可达95%左右。

利用所建立的正交翻译系统，作者研究了两种代谢酶上赖氨酸氨基酰化的功能。丙酮酸激酶M2（PKM2）是糖酵解关键酶，其K62和K66位点存在赖氨酸缬氨酰化修饰。酶活测定结果显示，K62或K66位点的缬氨酰化分别使酶活降至野生型的27.2%和38.7%，而相同位点的乙酰化修饰仅导致酶活部分下降。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）是磷酸戊糖途径关键酶，其K403位点存在赖氨酸酪氨酰化修饰。酶活测定表明，该位点酪氨酰化导致酶活完全丧失，而酪氨酸或色氨酸取代以及乙酰化修饰后G6PD仍保留一定活性。

最后，作者在HEK293T细胞中表达K62位点缬氨酰化的PKM2后，细胞糖酵解速率显著低于表达野生型PKM2的细胞，与体外酶活测定结果一致。

总的来说，这篇文章通过遗传密码子扩展策略，建立了十种赖氨酸氨基酰化修饰的遗传编码工具，并揭示了代谢酶上特定氨基酰化修饰位点的功能。

本文作者：LCX

责任编辑：WYJ

DOI：10.1021/jacs.6c03157

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c03157