氧化还原酶在代谢过程中催化许多氧化还原反应的发生，在生物能量传导中起关键作用。由于它们极高的化学选择性、温和的反应条件和理想的催化效率，氧化还原酶在有机合成领域极具应用前景。事实上，在一些药物、燃料及食品添加剂的生产中，氧化还原酶催化的羰基不对称还原、碳氢键氧化、环氧化和拜耳-维利格氧化等已发挥了重大作用。氧化还原酶大体分为两类：一类用来催化底物氢化加氢，一类用于氧官能化反应；但无论二者哪种，在酶的催化循环中都需要氧化还原当量的参与。最常见的天然氧化还原当量是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子[NAD(P)H]，它可以介导两电子和一质子的转移从而实现氧化还原转化。自然界中超过 80％ 的氧化还原酶的催化活性依赖于 NAD(P)H，但它成本昂贵，限制了其在合成中的化学计量应用。多年来，关于辅酶再生的研究层出不穷，生物酶法、电化学法、 光化学法等各领域都硕果累累；但是治标不治本的方法拓展依然解决不了酶催化的瓶颈。“辅因子挑战”给我们带来新的思考，相比于全细胞催化及含酶促辅因子的仿生再生体系，非 NAD(P)H 依赖性还原过程更简单易行，这种“非常规”再生可以绕过辅因子而将氧化还原能力直接引入酶的活性位点，进而催化后续反应，更具实际应用价值。基于上述背景，代尔夫特理工大学的 Frank Hollmann 教授和张武元博士在 Chemical Communication 上发表了题为Nonconventional regeneration of redox enzymes - a practical approach for organic synthesis? 的专题文章，文中他们对常见氧化还原酶的“非常规”再生体系进行了综述和评价，重点关注于那些有合成应用的催化体系。

作者主要从氧化再生和还原再生两方面对氧化还原酶的“非常规”再生体系进行综述分析，图文详情如下：

氧化酶的氧化再生

常见的氧化酶多包含铜辅基或黄素辅基，催化过程中辅基从反应底物上捕获质子，自身被还原并氧化底物；其氧化再生伴随着副产物过氧化氢的生成（见图 1a）。氧气的使用一方面造成过氧化氢的出现，严重影响酶的催化活性；另一方面氧气扩散是整个催化过程的限速步骤。所以在氧化酶辅基的氧化再生中可以考虑用其他电子受体代替氧气进行反应。另外，电化学方法也是一种好的选择，二茂铁介质的使用能有效促进酶活性位点与电极的相互作用（见图 1b），但该方法还有待探索。

氧化还原酶的还原再生

黄素辅基能催化多种反应（见图 2），在老黄酶和黄素依赖型单加氧酶的催化中发挥重要作用。所以开发非 NAD(P)H 依赖性的黄素再生策略意义非凡。

老黄酶被广泛应用于碳碳双键的选择性反式加氢中，在氧化还原生物催化中具有十分重要的地位。表 1 列举了一系列非 NAD(P)H 依赖性的老黄酶再生方法。这些方法不仅能有效规避昂贵的烟酰胺辅酶的使用；还具有更高的催化化学选择性，例如在使用烟酰胺辅酶依赖型老黄酶催化羰基还原的过程中，除非老黄酶被高度纯化，否则它极易受到同样依赖于烟酰胺辅酶来还原羰基的醇脱氢酶的污染（见图 3）。

 ●  表 1. 非 NAD(P)H 依赖性的老黄酶及相关黄素酶的再生方法。

黄素依赖型单加氧酶的还原部分主要包括以下几方面内容：

讨论了不同酶的非 NAD(P)H 依赖性还原问题。首先，利用 mNADH （NADH模拟物）还原 2-羟基联苯-3-单加氧酶（HbpA）时，大于 85% 的还原当量被非生产性用于生成过氧化氢，而在使用 NADH 催化时这一值小于 10%。进一步的研究也揭示了 NADH 在 HbpA 再生中的重要作用：作还原当量 & 稳定 4a- 氢化过氧黄素中间体。其次，在还原苯丙酮单加氧酶（PAMO）时，只在少量 NADP⁺ 存在的情况下，才能实现 PAMO 的非 NAD(P)H 依赖性还原。

黄酮单加氧酶在有机合成中催化众多氧化反应，它拥有独特的两组分结构，它们负责黄素辅基的还原活化及生成的可扩散还原黄素辅基的实际氧化反应（见表 2）。这类酶的催化过程涉及非常复杂的电子传递链，而利用“非常规”再生策略可使其得以简化。以苯乙烯单加氧酶为例，表 2 列举了两组分黄素依赖型单加氧酶的再生途径。尽管它们的生产效率已接近自然系统，但就经济上的生产规模而言，其转化率仍低一两个数量级，高效再生途径有待进一步研究。

●  表 2. 苯乙烯单加氧酶作为两组分黄酮单加氧酶的实例

从催化角度讲，含金属酶亦有重要应用。黄素单加氧酶仅能催化被活化了的碳氢键，而金属基单加氧酶能直接催化碳氢键的氧官能化。在这类酶中应用最广泛的当属 P450 单加氧酶。

P450 单加氧酶的催化过程涉及两个连续的单电子转移步骤（见图 4a），由含 FeS 簇或黄素的低分子量氧化还原蛋白介导，且该过程与氢化物供体 NAD(P)H 不兼容。所以在用 NAD(P)H 作还原剂再生 P450 单加氧酶时（NAD(P)H 可通过甲酸脱氢酶（FDH）催化的甲酸氧化而同步再生），血红素 –Fe^III 不能直接接受 NAD(P)H 的氢化物当量，而是需要中继系统（如还原酶，介体）来完成还原当量的转移（见图 4b）。

此外，一些电化学过程（见图 5a）和光化学过程（见图 5b）能较好地与 P450 单加氧酶催化中的单电子转移途径相兼容，扩展了 P450 单加氧酶非 NAD(P)H 依赖性还原的方法。

无论是在两组分黄酮单加氧酶还原中还是 P450 单加氧酶的再生中氧气难题始终是一大挑战。反应中，90% 甚至更多的还原当量被传递至氧气，导致辅基再生与后续酶催化氧化过程解偶联，既带来了无用的反应循环，又产生了严重影响酶催化活性的活性氧。对 P450 单加氧酶来说，可能的解决方案是利用电化学阳极氧化水原位生成氧来控制反应体系中氧的水平；类似的方法对黄素单加氧酶同样适用；促进辅基和介体之间的电子传递也是十分有效的方法。另外，不依赖氧气的 P450 单加氧酶的氧化还原也可能是一个解决方法，理论上，该方法不仅可以避免氧气带来的解偶联问题，还能避免由氧气水溶性差而引起的可用性问题。过氧化氢分流路径可以实现该过程，考虑到大多数 P450单加氧酶对痕量过氧化氢不耐受，蛋白质工程被用来改造酶。

说到不依赖氧气的氧化还原，过氧化酶是天然利用 H₂O₂ 分流途径形成催化活性物种的血红素酶,其反应过程不依赖复杂的电子传递链，同时具有与 P450 单加氧酶相同的催化活性，表3总结了一些过氧化酶的应用实例。在这些过程中 H₂O₂ 的有效原位生成对于获得高转化率至关重要。一方面，必须提供足够量的 H₂O₂ 以维持催化循环；另一方面，为避免催化血红素基团的氧化失活，需要避免过量的 H₂O₂。另外，研究表明黄酮单加氧酶也可利用过氧化物分流途径，但天然黄素的弱亲电性不足以与 H₂O₂ 反应形成活性中间体 4a-氢化过氧黄素，科学家通过对其进行修饰而构筑了 H₂O₂ 驱动的硫氧化反应的手性“活性位点”，尽管不完善，这一尝试为今后 H₂O₂ 驱动的黄酮单加氧酶催化的氧官能化反应相关研究奠定了基础。总的来说氧气困境这一难题还需更深入的研究。

●  表 3. 原位生成过氧化氢驱动的过氧化酶催化相关反应

• 铜-和黄素依赖型氧化酶的氧化再生

• 老黄酶的非 NAD(P)H 依赖性还原再生

• 两组分黄酮单加氧酶的非 NAD(P)H 依赖性还原再生

• P450 单加氧酶等含金属辅基氧化还原酶的非 NAD(P)H 依赖性再生

• 黄素类氧化还原酶“非常规”再生中的氧气困境

• Nonconventional regeneration of redox enzymes – a practical approach for organic synthesis?
  Wuyuan Zhang and Frank Hollmann*（代尔夫特理工大学）
  Chem. Commun., 2018,54, 7281-7289
  http://dx.doi.org/10.1039/C8CC02219D

  

  
  

Dr. Frank Hollmann 

Delft University of Technology

Frank Hollmann 博士曾于德国波恩大学学习化学，在瑞士苏黎世联邦理工学院获博士学位（Andreas Schmid 教授指导），在马克斯·普朗克煤炭研究所 Manfred T. Reetz 教授课题组任博士后，之后他加入 Evonik 担任研发经理。2008 年以来就职于代尔夫特理工大学生物催化小组，主要致力于氧化还原酶在有机合成中的应用研究。

Dr. Wuyuan Zhang 

Delft University of Technology

Wuyuan Zhang 就读于荷兰代尔夫特理工大学，并于 2016 年在 Isabel Arends 教授和 Kristina Djanashvili 博士指导下获博士学位。他目前是该大学 Frank Hollmann 教授课题组的博士后研究员，主要研究光化学和/或酶促 C-H 键功能化反应。