分享一篇发表在JACS上的文章：UdgX-MediatedUracil Sequencing at Single-Nucleotide Resolution，通讯作者是来自同济大学的陈义汉院士、马红辉研究员和复旦大学的胡晋川研究员。陈院士主要从事心血管疾病临床工作和基础研究，马老师主要从事RNA甲基化修饰与表观遗传学研究，胡老师主要研究染色质环境中的DNA损伤与修复。
尿嘧啶U与胸腺嘧啶T具有相似的化学结构，也能与腺嘌呤A形成碱基配对。DNA中存在异常U，通常由脱氧尿苷(dU) 错误掺入或胞嘧啶脱氨形成，并且参与多种生理和病理过程，而dU的全基因组图谱对于研究这些过程非常重要。目前常用的dU全基因组鉴定的方法是化学法，该方法是要利用uracil-DNA N-糖苷酶（UNG）切割dU形成无嘧啶位点（apyrimidinicsite, AP site），但化学法缺乏足够的分辨率、特异性，难以区分dU、AP site、5fU、5fC等，导致一定概率的假阳性产生。为了解决DNA中dU精确鉴定的难题，作者在本文研究中首次提出了基于酶的检测方法——Ucaps-seq，即UdgX交联和聚合酶停滞测序。本文研究利用了在耻垢分枝杆菌中新发现的尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）超家族的一个新成员——UdgX，它不仅能特异性识别和切除DNA中的尿嘧啶，还能与脱氧核糖形成不可逆的共价键，这是它与UDG家族其他成员的区别。UdgX-DNA复合物即使在SDS、NaOH和热等条件下仍然能维持稳定，这赋予了UdgX在检测dU上具有独特的优势。为了高效和特异性地捕获UdgX-DNA复合物，作者还在UdgX上添加生物素标签。特异性实验中，作者将该UdgX与含有dU、dT、AP site或其他dT衍生物的ssDNA孵育，凝胶位移结果显示UdgX仅与尿嘧啶反应。此外，UdgX只能与ssDNA上的dU交联，而不能与dsDNA上的dU交联。随后，作者对含有dU的ssDNA进行了引物延伸反应，发现聚合酶恰好在dU位点前的核苷酸处停止，说明通过UdgX交联和引物延伸可以准确检测尿嘧啶的确切位置。
基于此，作者开发了Ucaps-seq：①基因组DNA剪切、末端修复，并连接到Adaptor1。②产物变性后的ssDNA与UdgX反应。③用固相可逆固定（SPRI）去除游离UdgX，防止UdgX与UdgX-dna复合物竞争。④用streptavidinbeads富集DNA-UdgX复合物。⑤将引物连接到Adaptor1的3'端，通过DNA聚合酶进行扩增。⑥产物经碱性处理后从beads中释放出来，连接到Adaptor2上，再扩增生成测序文库。⑦通过二代高通量测序识别dU位点。最后，作者在人工合成的DNA模型、诱导dU累积的细胞、B细胞模型中，验证了Ucaps-seq的准确性和分辨率，以及对基因编辑技术脱靶效应的识别能力。综上，本文报道了一种精准检测DNA中的dU的方法——Ucaps-seq。
本文作者：MB
责任编辑：Guo ZH
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c11269
文章引用：DOI：10.1021/jacs.1c11269
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