分享一篇发表在JACS上的文章：Enzymatic C-Terminal Protein Engineering with Amines。文章通讯作者是来自澳大利亚昆士兰大学的Thomas Durek和David Craik教授，他们课题组主要从事新型多肽药物的开发。本文中，他们利用一种天冬氨酰连接酶实现了蛋白C端的功能化衍生，相比sortase具有连接片段更小、催化效率更高的优势。
蛋白/多肽上位点选择性的修饰手段在药物开发、原位成像等领域具有广泛的应用，其中最具代表性的是利用转肽酶如sortase。这类转肽酶能够识别目标蛋白上的特定序列，并催化其与带有另一段特殊序列的片段反应，实现多肽间的拼接。此前的报道中发现了一种植物来源的新的天冬氨酰连接酶[C247A]OaAEP1，它相比sortase具有更高的催化效率，且识别序列更短(识别序列为-NGL-)。由于给所有的底物片段上都引入酶的识别序列是一个费时费力的过程，此前曾有报道加入氨基亲核试剂来代替sortase识别的多肽底物，因此本文作者希望探索这种策略能否同样被用于[C247A]OaAEP1上。与sortase类似，[C247A]OaAEP1的催化机理首先是蛋白底物在酶催化下形成活泼的硫酯键，因此理论上加入含氨基的亲核试剂能够直接与硫酯键反应得到取代产物。为验证这一假设，作者在加入 [C247A]OaAEP1及其识别的多肽底物后外加50mM的炔丙胺，能够在20min内检测到底物的完全转化，且将炔丙胺替换为巯基或羟基亲核试剂后反应均不会发生。除炔丙胺外，其余多种一级胺类型的亲核试剂均可高效地参与此反应，转化率最高达90%以上，二级胺的转化率则大大下降。即使对于连有复杂糖链的一级胺底物，反应的转化率也可达70%左右，说明酶对于底物结构具有很好的普适性。在多肽模型上完成对底物结构的拓展后，他们尝试在不同蛋白的C端进行衍生。对于C端带有-NGL-序列的eGFP、SUMO以及MBP，均能够得到目标的C端衍生化产物。由于偶联反应发生后掉下来的-NGL-片段能够作为亲核试剂与反应物竞争，为进一步提高反应的转化率，他们在-NGL-序列的末端额外添加了一个His，从而在加入Ni2+的条件下-NGLH-能够与其配位进而降低亲核能力。此外他们对反应的pH值进行了优化，发现在弱碱性条件下更利于反应的进行，在以苄胺为亲核试剂的条件下，优化后的反应转化率可达80%左右。最后作为应用，他们用这种新型C端衍生策略分别构建了抗体-药物偶联物、GFP的C端-C端偶联产物、以及同一蛋白N端和C端的先后标记，相比此前的方法，这种新型连接酶构建的偶联物具有连接片段更小、连接反应不可逆等优势。总之，这篇文章利用天冬氨酰连接酶[C247A]OaAEP1结合不同类型的含氨基亲核试剂实现了蛋白C端的多样化衍生。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c08976原文引用：DOI: 10.1021/jacs.1c08976
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