萜类化合物是已知天然产物中最大的一类，由着复杂多变的结构和强大的生物活性而备受人们关注。截至目前，已有超过95,000个萜类天然产物被报道，其中包括了18,000个二萜类天然产物，他们分别来自126种不同的二萜碳骨架。这些结构复杂多样的二萜碳架是二萜合酶以GGPP为底物所催化形成，再经由不同的后修饰酶修饰形成结构复杂多样的二萜天然产物。依据催化碳正离子形成的机制不同，可将萜类合酶分为I型和II型两类。I型萜类合酶通过结合金属离子催化焦磷酸基团的离去来形成碳正离子，而II型萜类合酶则通过催化尾部双键或环氧环的质子化来形成碳正离子，引发整个串联环化的起始。根据酶活性位点的结构不同，通过亲核进攻、氢迁移、Wagner-Meerwein重排、质子转移以及去质子化等级联反应，完成萜烯骨架的构建。

Verticillenes属于6,12双环家族二萜类天然产物，该家族天然产物具有特征性的双环[9.3.1]十五烷骨架（Figure 1）。1964年，首个该家族天然产物verticillol于松柏科长青树林中被分离和鉴定，后续在植物、苔类、珊瑚和昆虫中均有该家族天然产物的报道。Phomactatriene同样属于6,12双环家族二萜类天然产物并具有特征性的双环[9.3.1]十五烷骨架，二者在结构上较为相似。Lythgoe et al.推测verticillol的碳氢骨架verticillene可能是phomactatriene和taxadiene的生物合成中间体。近日，来源于真菌的二萜合酶PhmA已被报道能够催化phomactatriene的形成，但负责verticillene类萜烯骨架形成的萜类合酶尚未被报道。

本文中，通过基因挖掘，首次鉴定出两个verticillene合酶LxVS、AxVS和来自于链霉菌的phomactatriene合酶SiPS。基于verticillene应为phomactatriene的中间体的推测，结合蛋白结构的分子模型比对及定点突变实验，成功的将SiPS改造为LxVS和AxVS的同工酶。此外，来源于真菌中的二萜合酶PhmA作为SiPS的同工酶，二者在序列上不具有同源性，但具有较为相似的三级结构。以SiPS的改造结果为指导，结合三级结构比对，高效的将PhmA改造为AxVS的同工酶。以同样的策略，将LxVS和AxVS改造为phomactatriene合酶。最后，通过三级结构比对和定点突变实验，阐明两个verticillene合酶催化不同位点去质子化来淬灭碳正离子的分子机制。

萜类合酶的挖掘和功能鉴定

在课题组前期对萜类天然产物的挖掘中，偶然发现了一个来自于细菌Streptomyces iranensis DSM 41954的二萜合酶SiPS，其与PhmA在一级序列上没有任何同源性，却同样可以催化phomactin萜烯骨架的合成。前期通过同位素标记实验，作者已经阐明真菌来源phomactatriene (1)的重排机制。为了研究SiPS催化phomactatriene形成的重排机制是否与PhmA一致，我们通过投喂[2-13C]乙酸钠，并分得相应13C标记的产物，结果表明二者催化phomactatriene形成的重排机制应相同。基于phomactin类天然产物独特的结构特征和强大的血小板抑制剂活性，作者曾以PhmA为探针，尝试挖掘同样具有复杂环系的萜类天然产物，然而以此方法仅鉴定出6个PhmA的同工酶。因此，我们以SiPS为探针，在本地数据库和公共数据库中进行检索，发现有两个可能的萜类合酶与其聚为一支，分别是源自菌株Lechevalieria xinjiangensis CGMCC 4.3525的LxVS和源自菌株Amycolatopsis xylanica DSM 45285的AxVS。

为了验证LxVS和AxVS的功能，我们将lxVS和axVS分别克隆到pET22b质粒上，并转入能够产生GGPP的大肠杆菌中进行异源表达。对上述菌株发酵后离心收集菌体，加入甲醇重悬菌体并超声处理后将甲醇相行GC-MS分析，结果表明LxVS和AxVS的E. coli异源表达菌株的代谢谱图中均有新峰积累。通过规模发酵并对其产物进行分离，结合GC-MS、核磁数据及旋光数据比对，确定LxVS的催化产物为(+)-verticilla-3,7,12-triene (2)，而AxVS的催化产物为(+)-verticilla-3,7,12(18)-triene (3)。化合物2和3同属于verticillene型天然产物，相较于化合物1，二者同样具有特征性的双环[9.3.1]十五烷骨架。化合物3曾作为橄榄科植物的次级代谢产物被报道，其具有促进伤口愈合、抗疟疾等活性。先前的报道中并未提及催化化合物3合成的酶，因此，AxVS是首次发现且天然存在的催化该化合物合成的萜类合酶。在植物次级代谢产物中，化合物2与3通常相伴存在，二者具有相同的骨架结构，唯一的区别在于化合物3中C-12、C-19位的双键在化合物2中迁移至C-12、C-13位。催化化合物2合成的酶同样未被报道，因此，LxVS是首次发现负责该化合物合成的萜类合酶。

蛋白结构预测与比较

化合物1、2和3结构上均具有双环[9.3.1]十五烷骨架，却经不同酶的催化形成结构各异的最终产物。基于化合物结构异同，对各蛋白催化不同产物形成的环化机制进行推测并比较讨论，以期阐明上述蛋白之间的联系。已知phomactatriene合酶PhmA以GGPP为底物，通过发生两步环化过程，完成双环[9.3.1]十五烷骨架的构建，形成碳正离子中间体B，该碳正离子中间体经多步的迁移过程形成phomactatriene。根据结构特征，推测verticillene同样利用碳正离子中间体B为前体，通过不同方式淬灭碳正离子，从而构建verticillene类萜烯骨架。

为了研究各萜类合酶催化不同化合物形成的酶学机制，我们对LxVS、AxVS和SiPS进行了结晶实验。遗憾的是，尽管进行了多次的尝试，我们仍未能获得LxVS、AxVS或SiPS的晶体结构。因此，作者使用AlphaFold2对以上萜类合酶的三级结构进行预测（Figure 2）。结果表明，SiPS具有I型萜类合酶经典的α-螺旋束折叠，包含10个由短loop区域连接起来的核心α螺旋（A-J）和3个较短的α螺旋（α1-α3），整个蛋白中不包含任何β折叠。LxVS与SiPS的序列同源性仅为33%，但二者的三级结构高度拟合，均方根偏差（RMSD）仅为1.102 Å。相较于SiPS，LxVS的三级结构中包含两个反向平行的β折叠，除此之外的各螺旋与SiPS高度重叠，仅loop区域之间存在些许差异。AxVS与SiPS之间的RMSD仅为0.995 Å，除loop区域外，二者仅存在三处较为明显的差异。相较于SiPS，AxVS中螺旋A被loop区域替代，B螺旋中不含loop区域。最为不同的是AxVS的C末端存在较长的loop区域，其背向催化空腔延伸，推测并不影响酶的催化活性。除蛋白整体的三级结构外，作者还对比了各蛋白活性口袋中的异同。SiPS与LxVS或AxVS催化口袋内部的氨基酸在空间位置上基本一一对应，仅部分氨基酸不同，推测正是这些氨基酸的差异导致了蛋白功能的不同。

SiPS的蛋白质工程改造

基于以上分析，作者利用定点突变技术将SiPS催化空腔中的氨基酸残基替换为LxVS或AxVS中相同位置的氨基酸残基，并利用GC-MS对其代谢产物进行分析。结果表明，SiPS V90N突变体仅催化化合物2的形成。进一步的定点随机突变实验表明，除V90N突变体外，V90Q、V90R突变体均能催化化合物2的产生（Figure 3）。结合理论计算，推测V90位点引入孤对电子，构建了阳离子中间体B与孤对电子之间的偶极-阳离子相互作用，进一步阻碍了后续的氢迁移和甲基迁移过程，再经由去质子化过程，从而形成verticillene类化合物。SiPS V90N突变体实现100%朝向LxVS的功能转换，而LxVS中与SiPS V90相对应的氨基酸即为N，该结果表明以三级结构为指导的蛋白质工程改造更具有高效性。SiPS N311S突变体的主要产物为化合物4，该化合物同样属于phomactatriene类萜烯骨架。相较于化合物1，原位于C1-C14位的双键迁移至C1-C15位。针对该位点的多个突变结果表明N311对最后一步的氢迁移过程至关重要，结合理论计算，推测N311可与碳正离子中间体D形成偶极-阳离子相互作用，使得下一步的氢迁移得以发生。S86T突变体中化合物2和3的混合物共占比约为20%，针对该位点的进一步的定点随机突变实验表明，SiPS S86Q突变体的代谢谱图中化合物3占比超过90%，推测其与V90功能类似，通过引入孤对电子从而阻碍了下游的迁移过程。此外，SiPS I188A突变体能够催化30%左右化合物4的形成。I188位于G1和G2螺旋之间的loop区域，已有文献报道该区域内的氨基酸位点是调控萜类合酶代谢产物流向的关键氨基酸。针对该位点的进一步顶点随机突变实验表明SiPS I188L突变体的代谢产物中仅能检测到化合物4的产生，表明该位点的突变同样阻碍了第二步氢迁移过程。而除此以外的其它SiPS突变体仍以1为主要产物。

PhmA的蛋白质工程改造

既已实现SiPS向LxVS和AxVS的蛋白质工程改造，作者推测可以将同样催化phomactatriene的萜类合酶PhmA改造为LxVS和AxVS的同工酶。针对SiPS的蛋白质工程改造结果表明，S86、V90位点对于第一步氢迁移和甲基迁移至关重要，而I188和N311位点则是负责最后一步氢迁移的关键氨基酸残基。PhmA作为SiPS的同工酶，虽然二者在一级序列上没有任何同源性，但其三级结构具有一定的相似性（RMSD：9.051 Å）。进一步分析二者活性空腔中的氨基酸不难发现，各氨基酸位点在空间位置上同样一一对应，且SiPS中已表征的关键氨基酸残基在PhmA中均存在相对应的同类型氨基酸，据此推测二者具有相似的酶学机制（Figure 4）。SiPS V90对应PhmA L90，针对该位点的随机定点突变表明，PhmA L90M突变体能够专一性催化化合物3的形成，而PhmA L90T突变体能够专一性催化化合物4的形成。由此表明该位点同样为调控代谢产物流向的关键氨基酸残基。此外，L90D、L90N、L90Q等突变体等比例的催化了2和3混合物的形成，表明该位点存在孤对电子时，同样阻碍了下游迁移过程的发生，接着通过去质子化作用形成不同的verticillene类萜烯骨架。该结果表明，SiPS与PhmA中的关键氨基酸的确一一对应且发挥着相同的作用。

除此之外，之前工作中针对PhmA酶学机制的研究表明，M188和L229同样为调控PhmA产物流向的关键氨基酸残基。针对M188位点的多个突变体中，均检测到大环类二萜天然产物的形成，据此推测M188是关键的空间位阻氨基酸。但M188G突变体中，仅检测到化合物2和3的产生，结合计算表明M188对后续的迁移过程同样至关重要。此外，M188P等突变体中还检测到了单环产物5-7的产生，表明该位点同样是促进第二个环形成的关键氨基酸位点。同样的，先前的研究表明PhmA L229A突变体主要催化cembrene A的产生，但将该位点突变为N时，其主要产物变为化合物2和3的混合物。基于以上结果表明，萜类合酶催化过程中，催化复杂反应过程不止依赖于单个的关键氨基酸残基，活性口袋周边的氨基酸组建的氢键网络同样是调控代谢产物流向的关键。基于以上推测，作者选取PhmA中多个位点进行定点随机突变实验，结果表明，包括L63F、F89R、F153P、V225A以及W307P等多个位点的突变体均能阻断后续的迁移过程，从而改变代谢产物的组成由此证明作者的推测。

LxVS和AxVS的蛋白质工程改造

既已实现phomactatriene合酶向verticillene合酶的功能转换，作者接下来尝试在verticillene合酶LxVS和AxVS中构建复杂的重排过程，以期实现verticillene合酶向phomactatriene合酶的功能转换。根据前文研究结合蛋白质三级结构比对，将LxVS和AxVS中与SiPS S86、V90、I188和N311相对应的氨基酸位点进行突变。结果表明，针对LxVS N85位点的多个突变体（N85A、N85V、N85S、N85T）均能够催化化合物4的形成，表明该位点是催化碳正离子中间体B发生下一步氢迁移和甲基迁移形成碳正离子中间体D的关键氨基酸位点。此结果与前文相一致，由此实现了verticillene合酶LxVS向phomactatriene合酶的

功能转换。在此基础上，作者尝试构建D到E的氢迁移过程。已知SiPS中I188和N311是构建D到E氢迁移过程的关键氨基酸，因此作者构建N85V/S308N和N85V/V183I双突变，期望LxVS能够催化phomactin萜烯骨架的形成。此外，进一步分析LxVS催化空腔不难发现，LxVS L77靠近多个碳正离子中间体，推测该位点对后续的多步迁移过程同样重要。针对该位点的定点随机突变结果表明，LxVS L77A、L77E突变体能够催化化合物1和8的形成，由此表明该位点是后续多步迁移过程的关键氨基酸位点。针对AxVS的多个突变体几乎全部保持了仅产生化合物3的特性。但作者发现AxVS A74S/S78V突变体中检测到化合物4的产生，表明以上位点为AxVS中构建B到D的关键氨基酸位点，由此实现了verticillene合酶AxVS向phomactatriene合酶的功能转换。在此基础上，通过构建AxVS A74S/S78V/A300N三突变，期望LxVS能够催化phomactin萜烯骨架化合物1的形成。

既已实现verticillene合酶向phomactatriene合酶的功能转换，作者最后还对LxVS和AxVS中最终淬灭碳正离子的酶学机制展开研究。对比化合物2和3的结构可以发现，LxVS和AxVS应同样拥有碳正离子中间体B作为生物合成中间体。以同样的策略比对LxVS和AxVS中的关键氨基酸残基，利用定点突变技术将SiPS催化空腔中的氨基酸残基替换为LxVS或AxVS中相同位置的氨基酸残基，并利用GC-MS对其代谢产物进行分析。结果表明，针对LxVS F58位点的多个突变体中均检测到化合物3的存在，其中F58S和F58N突变体仅能催化化合物3的产生，由此证实F58是催化区域选择性去质子化的关键氨基酸。

结合计算阐明SiPS、PhmA、LxVS和AxVS的酶学机制及彼此之间的联系

既已实现phomactatriene合酶和verticillene合酶的功能转换，作者通过计算结合实验结果，进一步阐明以上萜类合酶的催化机制，并阐明各自之间的联系。当底物GGPP进入SiPS的催化空腔后，受活性口袋形状限制折叠成利于反应发生的构象。接着，在酶的催化作用下焦磷酸基团离去，经两步环化过程形成碳正离子中间体B，完成双环[9.3.1]十五烷骨架的构建。在LxVS和AxVS中，碳正离子中间体B 经不同位点的去质子化过程从而形成化合物2和3。而SiPS中，碳正离子中间体B经需经过多步的迁移过程，最终在C-14位去质子化从而形成化合物1。

本文中，通过基因挖掘，首次鉴定出两个verticillene合酶LxVS、AxVS和来自于链霉菌的phomactatriene合酶SiPS。基于phomactatriene和verticillene结构的相似性和差异性，结合蛋白结构的分子模型比对及定点突变实验，成功的将SiPS改造为LxVS和AxVS的同工酶。来源于真菌中的二萜合酶PhmA作为SiPS的同工酶，二者在序列上不具有同源性，但具有较为相似的三级结构。以SiPS的改造结果为指导，结合三级结构比对，高效的将PhmA改造为AxVS的同工酶。以同样的策略，将LxVS和AxVS改造为phomactatriene合酶。此外，通过三级结构比对和定点突变实验，阐明两个verticillene合酶催化不同位点去质子化来淬灭碳正中心的分子机制。本工作为萜类合酶的酶学机制研究提供了理论指导，并为其它活性萜类天然产物的挖掘和酶的工程改造提供了依据。