分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为“ Unveiling the hidden interactome of CRBN molecular glues”。通讯作者是来自美国丹娜-法伯癌症研究所的Katherine A. Donovan和Eric S. Fischer两位教授。他们的研究通过整合结构生物学、细胞生物学与生化重建技术，致力于解析多蛋白泛素连接酶复合体的分子机制。

基于蛋白降解剂的分子作用机制，全局蛋白质组分析已被证明是识别蛋白降解靶点的有效工具。通过该方法，针对多种治疗靶点类别的降解剂靶点谱已得到广泛绘制。尽管该方法极大拓展了已知靶点的范围，但其有限的灵敏度限制了在无需筛选细胞系库或使用富集方法的情况下识别低表达水平蛋白的能力。该方法还存在一个关键盲区：无法识别那些被募集至连接酶但最终未被降解的蛋白。这类"非降解性分子胶"靶点可能由于以下原因存在：赖氨酸可及性差、缺乏降解性泛素链形成、去泛素化酶活性高、蛋白酶体可及性差或其他耐药机制。然而，若能克服这些因素将沉默型分子胶转化为分子胶降解剂或靶点功能调节剂，这些底物仍具有重要治疗意义。

作者首先简化了传统免疫沉淀质谱（IP-MS）方法。通过在细胞裂解液体系中引入重组蛋白作为诱饵，能够创建生物变异性更低、可扩展性更强的受控实验环境。该工作流程利用小分子降解剂在细胞裂解液中诱导三元复合物形成，采用重组FLAG标签CRBN与DDB1（剔除BPB结构域形成ΔB突变体）的复合物，这种缺失突变可阻止CUL4结合，从而抑制招募靶点的泛素化。孵育后，使用高特异性FLAG表位标签抗体进行富集，随后通过无标记定量蛋白质组学分析鉴定相互作用蛋白。

为评估该方法鉴定蛋白-相互作用的可行性，作者选择两种经过充分研究的代表性降解剂分子：已发表报道中深度表征的IMiD分子胶泊马度胺（pomalidomide）和激酶靶向异双功能降解剂SB1-G-187。泊马度胺筛选在两种细胞系中共鉴定出11种不同富集蛋白（MOLT4中9种，Kelly细胞中4种），其中包括三个未知靶点：ASS1、ZBED3和ZNF219。SB1-G-187激酶降解剂筛选在两种细胞系中共鉴定出18种富集靶点（MOLT4中16种，Kelly细胞中7种），其中包括多个非蛋白激酶靶点。

接下来，作者采用经济高效的Opentrons OT-2液体处理平台，实现了从所有免疫沉淀组分添加到胰酶消解的全程自动化样品制备，可并行处理96个样本。为探索化学招募至CRBN的蛋白范围，作者构建了20种不同IMiD类似物库。令人惊讶的是，两个细胞系共鉴定出298个富集蛋白，其中发现了270个新靶点，大部分蛋白都含有G-loop基序。这些IMiD靶点表明，其靶向范围已突破C2H2锌指蛋白家族的局限，拓展至包括蛋白激酶和RNA代谢相关蛋白在内的多种蛋白家族。

接下来，作者构建了6000种不同IMiD类似物的分子胶库。首先用TR-FRET检测该库中化合物诱导PPIL（PPIL4在前面实验被证明为CRBN的新底物）向CRBN的招募，以此对库进行筛选。通过全剂量滴定评估先导化合物的招募效能，最终，成功鉴定出化合物Z6466608628——该分子产生更高的520/490比值，且EC50达0.34 μM（FPFT-2216为1.05 μM）。

在本研究中，作者建立了一种简便、稳健且灵敏的工作流程：通过在细胞裂解液中引入重组型活性缺陷CRBN-DDB1ΔB复合物与降解剂分子，促进化合物诱导的复合物形成，从而高通量发现降解剂诱导的蛋白-蛋白相互作用，并推动选择性工具分子与治疗候选物的转化开发。通过对约6000种IMiD类似物库进行靶点PPIL4的筛选，作者鉴定出一种选择性先导降解剂分子。

本文作者：CZH

责任编辑：TZS

DOI：10.1038/s41467-025-62099-w

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-62099-w