多肽和蛋白质

蛋白质是由氨基酸通过脱水缩合而成的有机分子，蛋白质中氨基酸的顺序是由编码此蛋白质的基因决定的。蛋白质和多肽往往以分子量进行区分，一般分子量大于1万的称蛋白，低于1万的称多肽。蛋白质或多肽的具体结构是指他的具体的氨基酸序列，书写顺序是从左侧的游离氨基端到右侧的游离羧基端，氨基端通常被表述为N-端，羧基端通常被表述为C-端，需要强调的是在多肽固相合成中，多肽是由C-端向N-端合成的。多肽通常由组成肽链的氨基酸个数命名，如由两个氨基酸组成的多肽叫二肽，由十个氨基酸组成的多肽叫10肽。

胸腺5肽实例：L-精氨酰-L-赖氨酰-L天冬氨酰-L-缬氨酰-L-酪氨酸。左数第一个氨基酸为精氨酸，氨基游离，是胸腺5肽的N-端；右数第一个氨基酸为酪氨酸，羧基游离，是胸腺5肽的C-端。而在固相合成的时候，是从酪氨酸开始合成的。

氨基酸

氨基酸是一个包含有氨基和羧基的分子，天然存在的氨基酸有20种，这20种标准氨基酸又称作α-氨基酸，氨基和羧基连在同一个碳原子上（α-碳）。这20个标准氨基酸的种类是由连在α-碳上的第三个基团决定的，我们称之为R-基团。这些不同的R-基团决定了多肽或蛋白质的高级结构。这些R-基团之间的相互作用会使肽链自身折叠，形成离子键，共价键，氢键。这会使多肽链形成二级结构，包括α-螺旋，β-折叠。

除了最简单的氨基酸甘氨酸外，其他的氨基酸的α-碳都是手性中心，每一种氨基酸都存在两种构象，L-构型和D-构型。天然存在的多肽和蛋白质都是由L-构型的氨基酸组成的。

每一种氨基酸都可以由三个字母缩写或一个字母缩写表示（这些内容需要记忆，后面为大家提供一个表格，方便记忆）。如上面提到过的胸腺5肽，可以表示为：Arg-Lys-Asp-Val-Tyr，也可以表示为：R-K-D-V-Y。除了特殊说明外，右侧C-端为游离羧基，左侧N-端为游离氨基。有时为了增加多肽的稳定性，我们对C-端酰胺化修饰，N-端乙酰化修饰。

氨基酸实例

氨基酸分子量表

需要指出的是，在固相合成中氨基酸的游离氨基使用Fmoc，Boc保护的。很多氨基酸的R-基团在固相合成中会影响反应，我们通常也对这些基团进行保护。所以多出了一栏带保护基的分子量。羟基，羧基通常用“tBu”保护。碱性基团如氨基通常用”Trt”，”Boc”保护。胍基通常用“Pbf”保护。

保护基实例

• 亲水性氨基酸：DE H K Q R S T N

• 疏水性氨基酸：AF I L M P V W Y（这里的亲水性氨基酸是指天然的不带保护基的氨基酸，而多肽合成中亲水氨基酸的亲水基团通常被疏水性基团保护）

• 碱性氨基酸：KR H

• 酸性氨基酸：DE

• KT检测法显砖红色或无色氨基酸：SP D N

• 易被氧化氨基酸：CM Y W

• 易消旋氨基酸：HC

树脂 

在固相合成中，氨基酸从C-末端一个一个接到肽链的N-末端。在这过程中，不断增长的肽链的游离氨基和下一个氨基酸的羧基缩合，直到合成完毕。为了避免副反应，我们通常把即将接到肽链上的氨基酸的氨基保护。目前主要的保护策略有两种，Boc策略(氨基酸的α氨基被Boc保护)和Fmoc策略(氨基酸的α氨基被Fmoc保护)。不断增长的肽链的C末端通过一个连接基团与固相树脂相连，我们把这个基团称为“Linker”。目前广泛使用的树脂有PAM,MBHA, Wang, 2-Cl-Trt, Rink-Amid等，一般都是聚苯乙烯-二乙烯基苯材料，交联度大多是1%，因为在这种交联度下，树脂在DMF，DCM，中具有良好的溶胀性能，反应物分子可以在树脂内部自由移动。取代度单位为mmol/g，表示1g树脂有多少mmol反应位点。不同的树脂决定了Linker的稳定性。对于Fmoc策略，每偶联完一步都要用碱脱除Fomc，所以树脂的Linker必须是碱稳定的，比如2-Cl-Trt树脂。而PMA，MBHA用在Boc合成策略中，目前大多采用Fmoc合成策略。

注：黑色实心球为PS球，每种树脂使用前都需用合适的溶剂进行溶胀，常用的有DCM，DMF

合成循环  

固相多肽合成主要通过重复两步主要的反应来完成--脱保护和偶联，之后从树脂上裂解下来，沉淀，离心得到粗品。

脱保护（这里只讨论Fmoc策略） 

目前常用的脱保护试剂为哌啶，哌嗪。其中哌啶最为常用，通常使用15%至30%的哌啶/DMF溶液脱保护，脱保护效率高是其优点，但哌啶是合成毒品“天使粉”的原料，没有易制毒化学品使用证明的同学在使用上会受到一定限制，而且在某些特定的序列使用哌啶脱保护会产生一些副反应。相比之下，哌嗪不是易制毒化学品，而且使用哌嗪脱除Fmoc保护会产生较少的副反应，但哌嗪在DMF中的溶解度有限，需使用乙醇/氮甲基吡咯烷酮体系，使用起来不方便，更重要的是哌嗪的PKa值要小于哌啶，在脱除Fmoc时可能导致保护基脱除不完全。

偶联 

目前最常用的偶联剂为DIC/HOBT，其他的还有HXTU/DIEA，Pybop/DIEA等，虽然DIC/HOBT在缩合效率上不如磷盐型和脲盐型缩合剂，但其价格便宜，能够有效抑制消旋和副反应。新型缩合剂Oxyma在多肽固相合成中也有优秀的表现。在使用DIC/HOBT应注意，DIC与氨基酸形成的活化酯可直接和氨基反应，但消旋的几率会很大；而且DIC酯会慢慢变为没有反应活性的酰基脲，浪费反应原料。而HOBT能快速把DIC酯转换为HOBT酯，HOBT的空间位阻作用会减小氨基酸的消旋，也能阻止无反应活性的酰基脲的生成。

 切割 

在Fmoc策略中，使用TFA把多肽链从树酯上切割下来的同时也可以把氨基酸的侧链保护基一同脱除。被脱除的侧链保护基可能会再次连接到多肽链上，有的氨基酸含有易被氧化的基团(-HS,-OH)，所以经常在TFA中加入一些保护基清除剂和抗氧化剂，包括

• 水：清除tbu

• 三异丙基硅烷：清除Trt，Pbf

• 乙二硫醇：清除tbu，防止Cys，Met氧化

• 苯甲硫醚：防止Cys，Met氧化

• 苯酚：防止Tyr和Trp氧化

• 对于不同的序列，应根据实际情况选择合适比例的切割剂。

• 乙二硫醇有不可描述的气味，使用时应多加注意。

• 切割完成后选择合适的沉淀剂(如乙醚，正己烷，石油醚等溶剂)可以沉淀离心得到粗肽。

来源：药事纵横