手性化合物色谱分析方法开发(四)

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概述

手性化合物液相色谱分析方法开发过程中,根据化合物的结构特点或者是进行初步的开发尝试,确定了影响分离有效性的关键因素如色谱柱的类型以及流动相的种类以及操作模式之后,就需要对是否需要使用添加剂以及哪一种添加剂做出选择,一些其他的操作条件诸如流速,色谱柱柱温等进行优化,以此获得良好的分离效果。

 

一般地,对于手性化合物液相色谱分析方法的开发,我们前期开发关注的主要内容有以下几个方面:选择性因子(α),主要体现分离度的大小;容量因子(k),主要体现保留时间的大小;拖尾因子(Tf),主要体现色谱峰的对称性,分别如下图1-1,图1-2以及图1-3所示。在同一个开发实例中,不一定需要同时对以上三个方面进行调整,需要根据具体的情况以及分析方法开发的接受标准而定。


Fig.1-1 Main factor of α in a chiral method development

Fig.1-2 Main factor of k in a chiral method development

Fig.1-3 Main factor of Tf in a chiral method development


影响选择性因子、容量因子以及拖尾因子的因素,既包括之前涉及的色谱柱、流动相、操作模式,也包括添加剂的种类、色谱仪器的使用条件(流速,柱温、溶解样品的溶剂的种类,样品的浓度与进样量以及DAD检测器的检测波长设置等因素。

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添加剂的种类与选择

一般地,手性添加剂主要是指一些有机酸碱,如常用的有机碱:二乙胺(DEA),三乙胺(TEA),乙醇胺(ETA),异丙基胺(IPAm),N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)等;常用的有机酸:甲酸(FA),三氟乙酸(TFA),乙酸(AceticAcid)等,此外还有一些不太常用到的有机酸如,甲磺酸(MSA),乙磺酸(ESA)添加在拆分碱性化合物的流动相中。

 

添加剂的添加的方式一般是根据手性化合物所含有的功能基团而定,一般地,酸性化合物添加有机酸类添加剂;碱性化合物添加有机碱类添加剂;两性离子化合物可以选择添加酸性或碱性添加剂甚至同时添加酸碱类添加剂,对于中性待分离的手性化合物而言,流动相中是否添加酸碱添加剂对其分离效果的影响可以忽略不计。

 

在流动相中添加酸碱有机添加剂的作用,无外乎以下几种作用中的一种或者多种:

(1) 抑制或者促进化合物的官能团的解离;

(2) 抑制固定相基体硅羟基的解离,减小二次相互作用,减小拖尾因子,提高色谱峰的对称性;

(3) 调节待分离化合物的容量因子,得到合适的保留时间;

(4) 调节某一方向上驱动力的大小,实现有效的分离;


一般地,有机酸碱的累计添加量不超过0.5%,否则可能会对色谱柱产生损害以至于减少色谱柱的实际使用寿命。



Fig.2-1 Effect of additives on the retention time

 

如上图2-1所示,待分离手性样品为含有羧基的有机酸类化合物,由于化合物本身呈现酸性,在流动相中不添加醋酸的时候,化合物本身由于解离呈现出强极性与色谱柱极性固定相之间呈现强结合作用,在40min内未被洗脱出来(如图2-1A所示)。当在流动相中添加0.1%的醋酸之后,由于添加的乙酸抑制了酸性化合物的解离,使得该化合物的极性降低,在10min内就实现了有效分离(如图2-1B所示)。


Fig.2-2 Effect of additives on the peak shape and tailing factor

 

而对于上面的碱性样品而言(如图2-2所示),在添加0.1%DEA之前,色谱峰如山包一样,保留时间跨度十分大(如图2-2A所示);而当添加了0.1%的DEA之后,不仅实现了基线分离而且色谱峰的峰形也十分对称(如图2-2B)。在这个例子中添加的DEA的作用可能有两个,其一是抑制碱性化合物的解离,其二是降低了该化合物的溶剂效应。

 

有机酸碱类添加剂除了影响手性化合物的保留时间以及改善色谱峰的对称性之外,亦会对手性化合物的分离选择性产生很大的影响,如下图3所示。


Fig.3 Effect of additives on the resolution between the peaks ofisomers

 

上图两个例子中,流动相的种类,添加剂以及色谱柱的类型完全一致,唯一的区别在于分析的化合物的结构上的差异。在图3a中,随着有机酸FA的添加比例的增加,化合物的保留时间减少且分离度变差;而在图3b中,随着有机酸FA的添加比例的增加,化合物的保留时间大幅度增加且分离度变大,实现了基线分离。

 

以上几个例子说明有机酸碱添加剂及其添加量不仅影响手性化合物色谱峰的拖尾因子以及保留时间同时也会对分离的选择性产生较大影响,而这些作用的程度与作用的方向与具体化合物的结构特点密切相关。

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流速的影响

根据范式方程的图形示意图,如图4所示,不同的色谱柱均具有一个最佳的线速度范围,在该范围之内的理论塔板高度最低,且该范围随着填料颗粒粒径的减小而有所扩大。使用色谱柱供应商推荐的流速范围内的线速度,可以获得最大的理论色谱柱柱效,但需要注意一点,色谱柱的柱效达到最大的时候,对于手性化合物的拆分效果不一定是最好的。


Fig.4 Diagrammatic sketch for Van Deemter

 

如一根250mm的IC色谱柱(填料颗粒5um),其推荐的流速为1 mL/min左右,有很多时候,在推荐流速下,色谱峰不能实现良好的分离效果,通过降低流速,可以改善分离度达到基线分离,而此时的色谱柱的柱效,显然不是最大。再如,在推荐流速下,色谱峰之间的分离度远大于1.5,此时,我们可以通过增加流速的方式,减小分析物的保留时间,同时色谱峰的峰形收窄,峰宽降低,表观色谱柱柱效增加。

 

因此,对于流速的选择,需要根据所遇到的具体的分离情况进行选择,首先可以使用推荐的流速进行初始尝试,根据获得的色谱分离结果,适当调整流速的大小,获得良好的峰形以及分离度。

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溶剂的选择

样品溶解所用溶剂对于手性分析方法的开发的最大影响在于溶剂效应,特别是在正相色谱中,更容易出现溶剂效应。如下图5所示,图中的实例均是溶剂效应的具体表现。

Fig.5 Solvent effect in the chiral method development

 

归根结底,溶剂效应是由于溶剂与流动相之间的差异过大,二次分配时间过长或者溶解性差异过大导致。一般地,溶剂效应的大小还与进样体积的大小有关,进样体积越大,溶剂效应越明显。

Fig.6 The example of Solvent effect

 

如上图6所示,待分离样品在以正己烷作为溶剂的时候,随着进样体积的增大,并没有出现明显的溶剂效应,而当改为极性溶剂如异丙醇或者甲醇之后,随进样体积的增加,溶剂效应变得很大。

 

避免溶剂效应,最好选用流动相作为溶剂或者与流动相混溶的溶剂,此外也与分析物以及固定相的性质有关。

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结论

选择了合适的色谱柱,流动相的组成以及操作模式只是手性分析方法开发成功的必要条件,还需要对色谱仪器的操作条件进行优化,如流动相中的添加剂的种类以及添加量,流动相的流速的大小,溶解样品所用的溶剂等,均对分析方法主要关注点如分离度,拖尾因子,保留时间产生很大的影响。一般地,溶剂以及流动相添加剂的选择需要考虑化合物的结构以及所含有的官能团情况,而流动相的流速的选择,需要根据色谱峰分离情况做出调整,而不必要使色谱柱的理论柱效达到最大。



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