▲第一作者：丁阳；通讯作者：黄维院士、李林教授、程夏民副教授
论文DOI：10.1002/anie.202006635
近年来，抗生素的误用和滥用导致了β-内酰胺酶的变异和相应的耐药菌的广泛传播，对人类健康以及世界社会和经济造成了深远的影响和危害。因此，在传统抗生素即将失效的时代背景下，本文总结了前人的工作经验，系统的阐述了β-内酰胺酶各类亚型的蛋白结构、功能以及分类，提出了β-内酰胺酶荧光探针的设计思路，归纳划分了各类β-内酰胺酶抑制剂的适用范围和作用机理，并且阐述了各类荧光探针和抑制剂在对于耐药菌、疾病模型和临床治疗中的应用，并进一步展望了下一代β-内酰胺酶荧光探针/抑制剂的设计。抗生素是现代医学典型的药物类型之一，但是由于全球范围内人们收入的增加，获取抗生素的途径越来越简单，这使得抗生素的误用和滥用加速了耐药菌的进化。抗生药物耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）是指一个或多个药物用于治疗微生物引起的感染时，由于微生物相应的结构和活性改变导致药物活性明显下降，从而没有达到预期治疗效果的现象。现如今抗生素逐渐失去药效，给人和动物的健康及全球总体发展带来了严重威胁。世卫组织首份全球抗生素耐药报告显示，全世界正在面临严重的公共卫生威胁，估计约21.4万新生儿败血症死亡病例是由致病菌的耐药所导致的。新的全球抗菌素监测系统(GLASS)显示，在22个国家的50万疑似细菌感染患者中广泛存在抗生素耐药的问题。预计到2050年，全球范围内每年由于细菌耐药引起死亡的人数会上升至1000万，花费高达1万亿美金。在广泛使用青霉素之前，科学家们的观察就暗示了细菌能通过自身的酶降解青霉素。β-内酰胺类抗生素是在临床实践中使用最广泛的药物类型之一，该药物的药效团β-内酰胺四元环由于环键角小、环张力大，导致该类药物的化学性质不稳定，易被打开而失去抗菌活性。β-内酰胺酶存在于细菌的细胞壁与细胞膜之间，它会在抗生素抵达细菌合适的目标位点之前与抗生素的β-内酰胺四元环发生反应，使其开环从而让药物失活，因此β-内酰胺酶是细菌耐药的最主要原因。随着β-内酰胺抗生素的大量使用，细菌的耐药性变得越来越严重，导致临床中很多抗生素无效现象显著增加。抗生素选用之前，快速、有效和经济的诊断致病菌及其对抗生素的敏感性，对合理地使用抗生素、控制耐药菌程度、缩短患者的治疗时间和提高生存率等起到至关重要的作用。因此β-内酰胺酶的检测及抑制方法成为该领域备受关注的难题和研究前沿之一。本文通过总结前人的工作，从结构、功能、检测和抑制四个方向对β-内酰胺酶进行了系统的阐述，希望可以对今后科研工作者在β-内酰胺酶的研究和新型药物的研发中提供一些有价值的帮助和参考。截止至2018年，已有2800种β-内酰胺酶的亚型被报道，这些酶几乎可以让所有的抗生素失活。1980年Ambler按照氨基酸的同源性为基础将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四个类型，其中A、C、D三个类型为含丝氨酸的β-内酰胺酶，B类为含金属锌离子的β-内酰胺酶。1995年，Bush等人考虑到水解底物的特异性以及对克拉维酸钾的敏感性提出了Bush分类法（见表一）。后人又按照其水解的底物类型将分为青霉素酶（penicillinase）、头孢菌素酶（cephalosporinase）、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs，Extended Spectrum Beta-Lactamses）、碳青霉烯（carbapenemase）等。
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| Penicillins，Narrow-Spectrum Cephalosporins | |
| Penicillins, Narrow and Extended-Spectrum Cephalosporins, Monobactams | SHV-2 to SHV-6, TEM-3 to TEM-26, PER-1, SFO-1, CTX-Ms |
| | TEM-30, TEM-72, TEM-103, SHV-10 |
| Penicillins, Extended-Spectrum Cephalosporins, Monoamide | |
| Penicillins, Carbenicillins | |
| Extended-Spectrum Cephalosporins | |
| Penicillins, Carbapenems, Cephalosporins | IMI-1, KPC-2, SME-1, NMC-A |
| | | Most lactams (expect for monobactams), Carbapenems | IMP-1, IND-1, CcrA, VIM-1 |
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| Extended-Spectrum Cephalosporins | |
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通常A、C、D类β-内酰胺酶的活性中心为丝氨酸（丝氨酸β-内酰胺酶），B类β-内酰胺酶是以锌离子作为活性中心（金属β-内酰胺酶）。下图为丝氨酸β-内酰胺酶对青霉素的水解机制：青霉素与β-内酰胺酶结合后，受到丝氨酸的进攻而开环，同时以酯键连接形成酶与青霉素（开环后）的共价复合物，之后复合物受水分子进攻而开环形成青霉烷酸，同时酶恢复活性。近年来，在生物化学领域荧光探针以优秀的检测性能和成像效果受到广泛的关注。自1998年，诺贝尔奖获得者钱永健教授在《Science》上首次报道了基于β-内酰胺结构的荧光探针后，陆续出现了不少各类用于检测β-内酰胺酶活性的荧光探针。本文总结了前人的工作，将其分为（1）不同报告基团的荧光探针；（2）不同选择性的荧光探针；（3）锚定型荧光探针；（4）荧光探针在疾病模型中的应用。并且总结了各类探针设计中选择的底物、特异性识别的酶亚型、报告基团、反应机理和生物成像。通过现有的工作表明，在酶催化水解过程中，头孢菌素的四元环部分是深入到酶的活性口袋中的，因此四元环上的取代基大小及位阻效应会直接影响到对不同酶亚型的水解效率。因此本文在该部分提出了基于头孢菌素为底物的β-内酰胺酶荧光探针的设计原则。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制耐药菌中β-内酰胺酶的活性，当它与抗生素联合使用时能够保护抗生素不被水解，从而有效地对抗耐药菌。目前市面上主要的β-内酰胺酶抑制剂主要有克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦和法硼巴坦等。本文主要通过总结，将常用的β-内酰胺酶抑制剂分为（1）经典的基于β-内酰胺环的抑制剂；（2）非β-内酰胺环的抑制剂；（3）金属类β-内酰胺酶抑制剂，并且阐述了各类抑制剂的反应机理和适用范围。最后指出，目前为止，已经开发了许多金属类β-内酰胺酶抑制剂，但由于毒性和药代动力学的问题，很多抑制剂还尚未成功走向市场。然而，随着学科交叉融合和大数据时代的到来，以理论计算、分子力学分析、分子模拟对接等为基础的数学建模
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