DOI：10.1021/acsami.0c06964

Online：JUN 2020

杂志：ACS Appl. Mater. Interfaces

通讯作者：M. Hassan Beyzavi，University of Arkansas

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.0c06964

MOFs是一类由金属离子或金属簇与有机配体连接形成的晶体多孔材料，在固定化酶载体选择方面，MOFs材料相比于传统固定化酶和药物载体材料，具有高比表面、含有规整均一孔径，可根据需要使用不同配体，结构灵活可控等优势。它的介孔结构使得酶等生物大分子在MOFs外表面的包裹下具有更好的强度和稳定性。研究表明，酶可以被封装在MOFs的框架内，可以提高酶的活性，在封装的情况下，酶获得了抵御恶劣环境的能力。关于酶是如何进入MOFs并被固定在MOFs中以及合成包封酶负载对笼型MOFs的影响，目前还知之甚少。ADH作为合成酒精和生产生物燃料的重要酶，以前从未封装在MOF中进行过研究。基于以上几点原因，本文合成了ADH和PCN-333，对其包封性、稳定性和酶活性进行了研究。

本文合成了ADH和PCN-333并对笼型MOF-PCN-333(Fe)中ADH的包封、稳定性和活性进行了研究。发现缓冲液的浓度和酶的负载量之间具有相关性，缓冲溶液减少了酶与MOF之间的相互作用，并使其能够更深入地渗透到结构中，从而导致更高的酶负载，同时在各种pH值和温度下以及经过多次反应后均具有出色的稳定性。此外，还观察到了新的趋势，例如加载中的反弹效果和“越界”反应。

1. ADH在PCN-333中的包封

首先对ADH以及PCN-333进行合成。选择将MOF和酶的浓度保持在较低的浓度(0.5mg/mL)和1:1的重量比，以更密切地观察影响酶负载的因素。此外，选择了一个孔-酶体积比很小的酶-MOF对，PCN-333中最大的网孔直径为55Å，而ADH的尺寸为52×37×30Å。这个封装的表示如图1所示。通过测试这个变量，可以观察到这种大小的酶进入PCN-333中笼子外部较小的外孔的速率。

图1

1h后使用荧光标签确认ADH的固定化，并使用共焦荧光显微镜进行分离(图2e，f)，并将其与相同条件下的普通PCN-333进行比较(图2b，c)。这表明存在一种被PCN-333固定的酶，在颗粒的外部更为普遍，而在裸的PCN-333样品中观察到它的缺失。这证实了ADH的固定化。

图2

接着进行了负载试验。发现当加载溶液中的缓冲液浓度从10、33和100 mM增加时，ADH的负载也增加了(图3a)。这可能是由于相互作用的增加而产生的，例如氢键、伦敦分散力和偶极子相互作用，而不是与骨架的相互作用，后者减慢了酶在骨架孔隙中的运动。在MOF的堵塞处，更多的酶被困在MOF的外部。这些被阻断的酶然后在MOF的外部产生一个高浓度，导致通过浓度梯度淋溶回溶液中。当被阻碍的酶深入MOF时，其他酶被允许进入空出的孔隙，从而导致更高的吸收。基于这一理论以及实验结果(图3a,b)，可以得出100 mM缓冲液的较高负荷允许酶与MOF之间的相互作用更少，因此允许酶深入MOF并导致观察到的更高装载百分比。

图3

2. 稳定性研究

研究发现在室温下保存的ADH胶囊在反应时间为5分钟后，与保持在4°C的对照组相比，其活性损失了20%。相比之下，保持在室温下的游离ADH失去了所有活性而在同一时间内封装在4℃下的酶活性损失很小(图4a)。ADH@PCN-333在室温下的少量活性损失可能是由于MOF内载的酶量减少，这主要是由于未封闭的孔中位于MOF外部的酶的变性或部分展开所致，或是那些未完全进入孔内并处于非活性状态的酶。

除了图4a中稳定性试验中的温度比较外，还测量了酶-MOF复合物在不同条件下一周内的活性，以确定负载酶相对于其酶负载随时间的稳定性(图4b，c)。由图4b可以看出，在第0天和第7天之间，结果几乎没有差异，在第0天之后的测试中，4°C下的pH=7样品的表现始终优于其他样品。将NADH的消耗量与酶负荷量进行比较时，发现两者呈负相关(图4c)。可能是由于与温度相关的运动增加而产生的单个酶的进一步分离，赋予酶进一步穿透MOF的能力。随着负荷的增加，两种或两种以上酶进入同一个笼子的可能性也随之增加。这种空间的渗透和竞争可能导致这两种酶的不活跃。

图4

随时间加载试验(表1)与温度和缓冲试验(图3a和表2)方法的一个主要区别是，后一个样品被旋涡旋转，以便每天多次重新消耗溶液。较高搅拌的样品产生80%的产率，而接受较低搅拌的样品保留了大部分活性，这种破坏可能导致温度和缓冲试验中的负荷增加，而以牺牲酶活性为代价，而在持续时间试验中，酶活性保持不变，与游离酶相当。

表1

表2

3. 活性研究

3.1 pH值对ADH@PCN-333活性影响

由于ADH的活性已经被报道，所以选择研究的pH值是为了观察随着pH值的变化而变化的活性趋势。与预期一致，当pH值为9和11时几乎没有活性，两种形式的ADH在pH=7时的最高活性(100%)没有达到任何超过10%的活性(图5a)。

除此之外，该酶的行为似乎遵循其他报道实验的活性趋势。包埋酶活性较低的原因是上述反应混合物的搅拌和室温负荷，由此得出结论，要么是一些酶在进入MOF之前变得不活跃，在并入后没有恢复到它们的活性状态，要么是在同一个孔中酶的相互作用增加，导致两种酶都不能恢复到它们的活性状态。稳定性试验中的数据进一步证明了这一点，在相同条件下，样品不经常搅动，表现出相对相同的活性。因此，减少样品的搅动会导致活性酶和非活性酶的比例增加

pH=3下活性的增加支持了以下理论：分离酶和周围的MOF框架有助于提高反应速度，防止酶在不利的pH值下变质或展开。似乎pH值的控制，可能和其他条件一起，有可能在对反应有利而对脆弱酶不利的条件下，比天然酶更快地产生产物。实验中把这称为“越界”反应，因为这种反应发生在酶的自然边界或条件之外。

3.2溶剂对ADH@PCN-333活性的影响

图5b所示，ADH@PCN-333在水中浸泡24h后表现出最佳活性。可以归因于位于MOF中或附近的缓冲液浓度较小。在其他试验中，没有足够的时间或足够的迭代来完全去除MOF内高浓度的缓冲液。24 h的时间似乎允许从MOF复合物中抽出多余的缓冲液，从而使所容纳的酶更快地反应。

极性和溶剂的性质是影响ADH活性的重要因素，随着极性的降低，ADH的活性也随之降低。虽然一些酶在有机溶剂的作用下继续发挥作用，但这不是一个稳定的规律，可能是一个重要的因素。

3.3温度对ADH@PCN-333活性的影响

图5c所示，温度和酶的活性有直接关系，无论是在游离状态还是在胶囊状态下。在生理温度下，包被酶的性能并不优于游离酶。从60℃开始，包被酶最终显著优于游离酶。可以得出结论，包被酶活性的增加主要是由于它能够在MOF的笼内分离酶。

图5

4. ADH@PCN-333的可回收性

催化过程中酶的再利用能力是计算过程成本效率的一个主要因素，也是MOF封装酶的标志之一。先前的研究报告了固定化时ADH具有良好的可回收性，但仅在几个循环后活性就丧失了。相反，本文的结果表明，经过10个反应循环后，封装酶的活性没有下降(图6a)。这种优异的性能可以归因于笼型MOF能够更好地束缚其孔内的酶，并且MOF笼的尺寸与酶的尺寸相匹配，如前所述。这种相对体积的MOF-cage和酶使二者合二为一，似乎可以更好地分离被包裹的酶，并防止酶容易地渗入溶液中。

5. 产品确认

为了确认1-丙醇产物的存在并比较其产率，在观察到的最佳条件下对游离的ADH和ADH @ PCN-333 样品进行了GC-MS分析。游离酶产生的周转率为3.87 U/min，而ADH@PCN-333的周转率为4.64 U/min，酶活提高了20%(图6b)。这与在持续时间测试中观察到的活性增加相对应(图4c)。与其他试验相比，该酶的总体活性增加可归因于缓冲液浓度的降低。

图6