推荐一篇发表在ACS Cent. Sci.上的文章，文章标题是Immobilization of Biantennary N-Glycans Leads to Branch Specific Epitope Recognition by LSECtin。其通讯作者是巴斯克研究与技术联盟的Jesús Jiménez-Barbero。课题组从化学的角度探索分子识别事件，特别是在溶液中受体识别聚糖的分子基础。在本文中，作者用NMR对LSECtin识别不对称N-聚糖进行了研究。

LSECtin是Ca²⁺依赖性聚糖结合受体C型凝集素家族的成员，在肝脏、淋巴结、骨髓和血窦内皮细胞中表达。全长受体的一般结构由胞外结构域（ECD）、跨膜疏水结构域和胞内N端尾组成。ECD可进一步分为为颈部区域和碳水化合物识别域（CRD）。颈部区域的77和 159位存在两个N-糖基化位点，这两个位点对于LSECtin在细胞表面的有效表达至关重要。

在聚糖微阵列中，LSECtin倾向于结合α1-6分支上的GlcNAcβ1-2Man基序，而非α1-3分支上的异构体。而且，在α1-6分支上带有 β1-4 GalNAc/Gal延伸的复杂型N-聚糖被LSECtin识别，而在α1-3分支上相同的修饰则完全不能与LSECtin结合。这种选择性说明聚糖结构的细微差异会导致结合事件的显着变化。因此，作者通过NMR检测了LSECtin与不对称N-聚糖的识别过程。

图1. 本研究中使用的LSECtin的模型和配体

作者首先通过NMR研究了最小结合表位——GlcNAcβ1-2Man 二糖和LSECtin之间的相互作用。已有的报道表明，两者的结合亲和力为3.5μM。通过将配体添加到含有凝集素的样品中，进行了基于1H NMR的滴定实验，使蛋白质与配体的比例分别为1:0、1:1、1:2、1:5、1:10和1:20。在比例达到1:2之前，出现了NMR信号的变化，之后达到饱和，这与报道中低微摩尔亲和力的相互作用一致。

作者随后研究了LSECtin与图1中所示的复合型N-聚糖之间的相互作用。已有的报道表明，G0对LSECtin的结合亲和力为2.6μM。作者进行了与GlcNAcβ1-2Man同样的NMR实验，结果显示，G0表现出与上述二糖相似的趋势，表明两种分子与LSECtin的结合亲和力非常接近。在LDN3和LDN6中也进行了同样的实验，结果显示，两者具有相同的模式，表明溶液中两者与凝集素的相互作用类似，这与固定在聚糖微阵列上时对相同的N-聚糖进行观察的结果明显不同。

图2. GlcNAcβ1-2Man、G0、LDN3和LDN6滴定LSECtin的¹H NMR光谱

接着，作者对LSECtin和复合型N-聚糖形成的复合物进行了STD NMR实验。对于G0来说，大多数STD-NMR信号对应于两个末端 GlcNAc残基，其上的所有质子都是NMR等效的，因此无法区分。同时，其STD结果与GlcNAcβ1-2Man二糖一致，表明LSECtin通过该结构与N-聚糖相互作用。

图3. LSECtin和G0形成的复合物的STD NMR

而对于不对称聚糖，LDN3中6-Man残基的STD NMR信号很明显，未见3-Man残基的STD NMR信号。同样地，在LDN6中观察到了3-Man残基的 STD NMR信号，而6-Man残基的STD NMR信号却没有观察到。在GlcNAc残基也观察到了类似的现象，对于LND3，观察到了α1-6分支末端GlcNAc的STD NMR信号，而对于LDN6，α1-3分支末端的GlcNAc信号也出现在STD NMR光谱中。

图4. LSECtin和不对称N-聚糖形成的复合物的STD NMR

GlcNAc和GalNAc上N-乙酰基的STD NMR也侧面印证了结合模式。对于G0，两个GlcNAc的乙酰基的STD NMR信号都可以观察到。对于LDN3，仅出现α1-6分支的乙酰基信号，而对于LND6，仅观察到α1-3分支的乙酰基信号。

图5. GlcNAc残基上乙酰基的STD NMR

基于以上结果，作者认为末端的GalNAc起到了停止信号的作用，即阻止在该位点的结合，并提出了如图6所示的模型。

图6. LSECtin识别的N-聚糖结合表位

最后，基于以上结果，作者假设当聚糖附着在表面时，LDN3中 α1-6分支上的GlcNAcβ1-2Man表位受到阻碍，在溶液中则不会有这一问题。因此，作者通过分子模拟对LSECtin的识别进行了概念验证。在模型中，PEG8作为接头，固定在纤维素板上。从分子动力学模拟分析结果可以看出，α1,3连接的分支暴露在溶剂中，因此可以与受体结合，而α1,6连接的GlcNAcβ1-Man表位被部分掩埋在极性表面中，这可能使其与LSECtin结合的能力下降。

图7. LDN3和LDN6的分子动力学模拟

综上所述，作者在溶液中进行的NMR研究证实了GlcNAcβ1-2Man部分是LSECtin识别的最小表位。在溶液中，不对称的LDN3和LDN6都被LSECtin识别；而在聚糖阵列上，该凝集素仅识别LDN6。本文得到的结果在分子识别领域具有重要意义，分子识别会因所研究分子所处的状态不同而产生很大差异。以聚糖为例，阵列上的聚糖显然更接近于真实细胞表面的情况，其所得出的结论也更适合于从体外环境类推到体内环境。

文章作者：CXY

DOI：10.1021/acscentsci.2c00719

责任编辑：LD