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分享一篇发表在 Nature chemical Biology的文章，题目为“Functional E3 ligase hotspots and resistance mechanisms to small-molecule degraders”。文章中，课题组采用单倍体遗传学来说明靶向蛋白质降解（TPD）中不同的E3功能热点的组装结构特性，以呈现易获得耐药表型的残基。该文献提出了一种可快速和广泛使用的方法来表征小分子降解物和相关的耐药机制。
研究背景：
邻近诱导药理学最有力的实施方案之一是靶向蛋白质降解 (TPD) 的概念。在 TPD 中，小分子“降解剂”诱导 E3 泛素连接酶和感兴趣的蛋白质 (POI) 之间的分子接近，导致 POI的多泛素化和蛋白酶体降解。目前适用于 TPD 的许多 E3 连接酶是 cullin RING E3 泛素连接酶 (CRL) 大家族的成员。CRL 是围绕中央 cullin 骨架组织的模块化蛋白质组件。这还包括最常被已达到临床评估或批准的降解剂劫持的两种连接酶，即 CRL2VHL 和 CRL4CRBN。CRL中底物识别的特异性由 250 多种不同的底物受体 (SRs) 传递，例如上述的 cereblon (CRBN) 和 von Hippel-Lindau 疾病肿瘤抑制因子 (VHL)。在生理环境中，SRs 识别底物，例如基于翻译后修饰。因此，基础分子识别是基于互补和共同进化的蛋白质表面。基于 SR 的天然、高度多样化的功能，它们是小分子调制的理想切入点。 自然发生的底物识别是进化优化的，但小分子降解剂通常会诱导从头蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 的形成。因此，降解剂依赖于对所涉及的蛋白质表面的结构可塑性的最佳利用，并从诱导的接近度中利用 PPI 能量学。结构解析有助于塑造我们对 TPD 的理解，并且还可赋予三元复合体装配的预测计算模型 。 首先的研究发现，CRBN和VHL两种 PROTAC 的耐药机制不同，选用了研究耐药机制的常用工具KBM7 细胞以建立捕捉两种连接酶整体重要性概况的有效模型。实验数据（下图）表明SRs是抗降解克隆中最常突变的CRL成分。
随后通过深度突变扫描，在降解物结合袋和预测的新底物界面附近鉴定出许多点突变，这表明了SR在协调三元复合物形成中的重要性。研究人员计划以氨基酸分辨率系统研究两种 SR 的表面拓扑结构，为降解结合位点附近的所有 VHL 和 CRBN 位置（<10 Å，下图）设计了 DMS 库，分别涵盖 1,442 和 1,738 个不同的变体。值得注意的是，DMS 策略此前已成功用于研究小分子和靶蛋白之间的功能关系。随后对准备好的文库进行了测序，并主要确定了预期的错义变体。
在DMS 鉴定的功能性 VHL 热点显示新底物依赖性抗性和对 PROTAC 治疗的敏感性实验中，展示了系统性氨基酸突变的比较分析如何阐明以新底物选择性方式调节药物诱导降解的功能热点。单个突变的许多功能后果可以从结构的角度合理化（下图）。
之后该课题组将研究重点转向 CRBN，这是迄今为止唯一通过批准的进行临床验证的 E3 连接酶分子胶降解剂，来那度胺及其相关类似物，统称为免疫调节药物 (IMiD)。利用 DMS 方法系统地阐明了CRBN 突变对 CC-90009 功效的影响，CC-90009 是一种针对 GSPT1 的临床阶段分子胶降解剂（Surka, C. et al.2021）。将选择后的 CRBN 变体富集与 CC-90009 或 BET-PROTAC-dBET6（Winter, G. E. et al.2017）进行比较，得到了与两类降解剂形态相关的功能性 CRBN 热点（下图 a）。后续在检查 CC-90009（PDB 登录号 6XK9）的三元结构后，发现 CRBNN351 靠近蛋白质 - 蛋白质界面，并且能够与 GSPT1 的骨架羰基直接相互作用（下图d）。DMS 数据表明，仅对带负电荷的氨基酸天冬氨酸或谷氨酸的突变消除了 BET-PROTAC-dBET57 的细胞和降解功效。研究人员验证了密切相关的 dBET6 没有观察到这种突变效应（下图 b、e、f）。有趣的是，这个位置的突变也促进了对分子胶降解剂的抗性。
综上所述，该文献报告了 CRBN 热点，它们选择性地和普遍地调节降解剂的功效，并且在突变后，可以引起抗性或致敏。其中部分的影响可以通过结构调查来合理化。重要的是，DMS 还强调了因 IMiD 治疗复发患者的突变而中断的功能热点。 截至目前，临床实践的证据仅适用于基于 CRBN 的 IMiD，例如来那度胺和泊马度胺。积累的数据表明，多达三分之一的对泊马度胺治疗无效的患者存在各种类型的 CRBN 改变 。为了支持DMS 方法的潜在临床相关性，研究人员发现许多已识别的热点在 IMiD 治疗复发的患者中被破坏。一些已识别的热点似乎是分子胶特异性的，例如 CRBNP352，而其他热点同样是 PROTAC 效力所必需的，例如 CRBNF381。值得注意的是，该DMS 重组模拟了纯合突变的情况，而患者的突变也可能是杂合的。基于 CRBN 的胶降解剂（例如 CC-90009）和基于 CRBN 的 PROTAC 的临床试验的未来数据，例如 ARV-471（靶向雌激素受体）和 ARV-110（靶向雄激素受体）或基于 VHL 的 PROTAC ，例如 DT-2216（靶向 Bcl-xL）可能会揭示其他临床相关的功能热点。 本文作者：ZYY 责任编辑：F C DOI:：s41589-022-01177-2 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-022-01177-2
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