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分享一篇近期发表在Angew. Chem Int. Ed.上的研究进展,题为:Thioester-Assisted Sortase-A-Mediated Ligation。在该工作中,作者使用C端带有硫酯结构的多肽作为Sortase-A催化连接反应的底物,将该反应从可逆变为不可逆,大大提高了底物转化率,同时突破了原有反应的序列适用范围。该工作的通讯作者是来自清华大学的刘磊和中科大的孙德猛两位老师。
通过化学手段修饰或者合成蛋白质,以研究蛋白质的结构和功能的关系,乃至为蛋白质附加新的功能,是蛋白质化学研究的重要内容。连接反应(ligation)是将两个或多个肽段连接为一条新的多肽链的反应,被广泛用于蛋白质修饰。其中,转肽酶sortase A(SrtA)催化的连接反应具有酶易得、操作简单和稳健性好的优点,被广泛使用(图1a)。然而,该方法也存在两个明显的局限性:第一,从热力学上看,从底物到产物的自由能变化较小,因此反应是可逆的,无法实现完全转化;第二,SrtA的三维结构要求底物具有LPxTG序列,这限制了此方法的底物范围。
图1. SrtA催化连接反应
在反应机理上,SrtA的活性中心是半胱氨酸的巯基,而酶促反应的中间体是该巯基进攻肽段生成的硫酯。作者从SrtA的催化机理中得到灵感——是否能将LPxTG识别序列中的G残基替换为硫酯结构单元呢?如此一来,反应变为硫酯的胺解反应,在热力学上有利,是不可逆反应,从而可以大大提高底物的转化率(图1b)。
首先,作者合成了一系列C端带有不同硫酯末端的YALPET七肽,对设想进行了尝试(图2)。实验发现,带有巯基乙酸甲酯(MTG)硫酯的肽1(500 μM)和等当量的肽2混合,加入500 nM的SrtA,pH 7.0下反应三小时,可以实现底物的完全转化,产物结构得到了HPLC和MS的明确表征。相比之下,在相同反应条件下,C端为Gly-NH2的YALPETG肽4则仅有约50%的转化率。作者测量了两种不同底物的动力学常数,如表1所示。结果表明,SrtA虽然对硫酯底物的亲和力有所降低,但催化效率有所提高。随后,作者探究了其他硫酯结构的反应性,发现图2中的硫酯结构对应的转化率普遍在80%以上(图3),表明该方法对硫酯结构的容忍性较好。
图2. 概念验证
表1. 底物1和4的SrtA催化连接反应的动力学常数
图3. 不同底物的转化率-时间曲线
随后,作者认为既然酶对硫酯底物具有更好的催化效率并且反应不可逆,那么是否意味着硫酯底物可以允许LPxT序列的微小变化呢?为了验证这一猜想,作者合成了一系列C端带有MTG硫酯的肽,Y-A-P4-P3-P2-P1-MTG,P1~4是系统突变的位点(图4)。首先,作者固定P3-P2-P1为Pro-Glu-Thr,而仅改变P4,发现极性不带电残基和非极性残基均有大于90%的转化率,但对带电残基Asp和Lys效果较差。类似地,作者研究了P3、P2和P1的底物范围。P3和P2对多种残基都有良好的反应效果,即便是直接反应位点P1,也可以允许用Ala、Gly、Ser和Leu等残基进行替代。以上的研究表明,该方法对多种LPxT序列的变体都有良好的兼容性。相比经典的SrtA连接反应,底物适用范围大大拓展。
图4. 研究序列适用范围
注:推送篇幅有限,感兴趣者请移步原文。
综上,作者研究表明SrtA可以高效地催化一分子N端为Gly的多肽和另一分子含有LPxT衍生序列并带有C端硫酯的多肽的连接反应。这一方法是不可逆的,并且具有广阔的底物序列适用范围,解决了经典SrtA连接技术的两个主要问题,是蛋白质化学合成及修饰的强有力工具。
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