分享一篇发表在 JMC 上的文章，题目为“Discovery of Effective Dual PROTAC Degraders for Neurodegenerative Disease-Associated Aggregates”
特异性蛋白的聚集是各种神经退行性疾病（neurodegenerative diseases ，NDs)的组织病理学标志，其中的α-突触核蛋白（α-Syn）和tau蛋白得到了越来越多的关注。α-突触核蛋白和tau蛋白都是部分未折叠的蛋白，在病理条件下可形成毒性低聚物和异常细胞聚集体。近年来，α-Syn与tau蛋白之间的直接和间接交叉作用得到了广泛的研究。已有研究证明脑源性α-Syn/tau寡聚物复合物可以加速内源性tau寡聚物的形成，并且针对tau寡聚物靶向被动免疫治疗可以改善突触核蛋白病小鼠的认知和运动缺陷。目前，蛋白质靶向降解技术（targeted protein degradation，TPD）已经用于研究NDs的治疗，但是多靶点双官能团的分子仍未得到重视。因此，本文作者开发了一系列基于PROTAC的有效的降解分子，用于同时降解α-Syn聚集体和总tau蛋白。作者最终筛选出具有显著蛋白降解作用的双功能PROTAC分子——T3，并对其降解机制进行进一步探究，最终在小鼠模型中验证了T3的治疗效果。研究结果为双重PROTACs治疗NDs提供了潜在的治疗策略。
首先，作者设计并筛选了一系列双小分子的PROTAC降解剂（T1-10）。
接着通过对所设计合成分子异双功能分子T1–10的体外降解效率进行降解活性评估。作者先合成了化合物T1–3和T6–8，使用VH032和泊马度胺（POM）作为E3配体。基于作者之前工作报道的细胞模型，评估了降解剂对α-Syn聚集体和磷酸化α-Syn（pS129）的降解作用。经过对降解效果的初步筛选，采用POM的降解剂表现出更好的降解效果。作者接着设计合成了T4–5，其具有较长的接头和CRBN配体（POM），但未显示出良好的降解效果。T9作为一种小分子量化合物，具有更简洁的E3配体，但没有表现出良好的降解活性，作者推测可能是受限于其较短的连接子。最终，经过筛选，作者选择T3作为进一步机理研究的首选化合物。利用类似于HEK293T细胞中SNCA OE-PFF-接种模型的方法学框架，建立了tau PFF接种HEK293T细胞模型来评估异双功能分子T1-10对活细胞中总tau的降解作用，结果表明T3对tau也有很好的降解作用。因此，选择T3作为进一步机理研究的首选化合物。接下来，作者进一步评估了降解剂T3对αSyn聚集体的降解作用。通过WB实验得到T3半降解浓度（DC50）为1.57±0.55μM，降解速率最高（Dmax）为78%。随后，5μM的T3处理后，在不同时间点取样，监测降解动力学。结果表明，α-Syn聚集体水平在治疗期内有所下降。此外，通过免疫荧光染色验证了T3对α-Syn聚集体的降解作用。共聚焦与流式细胞术测定一起证明 T3 可以以剂量依赖性方式降解α-Syn聚集体，表现为α-Syn（+）点状物的数量和密度减少，荧光强度逐渐降低。
图2.化合物T3对HEK293T细胞中总tau的降解作用为了检验降解机制，作者使用化合物T3进行了进一步的研究。首先，通过进行无标记荧光偏振（FP）测定来检查 T3 与α-Syn或tau PFF的结合亲和力。结果表明，T3可以与两种蛋白质PFFs结合，解离常数（KD）分别为0.47±0.07和2.78±0.85μM，表明异双功能化合物对靶蛋白保持了相对较强的亲和力。此外，作者还合成阴性对照化合物（T3n），并在相同条件下处理含有对照化合物的细胞，以评估E3结合部分在化合物T3中的作用。无标记荧光偏振实验表明，它与聚集体的结合能力较低。此外，共免疫沉淀分析显示，T3处理后泛素化与α-Syn的相互作用增强，这表明T3促进了POI的泛素化水平。接下来，作者还进行了一系列功能抑制实验，以研究泛素化的POI是如何从细胞中清除的。结果显示，与蛋白酶体抑制剂MG132的偶联大大削弱了T3对α-Syn聚集体或tau蛋白的降解作用。此外，作者还评估了MLN4924（NEDD化抑制剂）的影响。结果表明，与MLN4924的结合大大削弱了T3对α-Syn聚集体p-αSyn或tau的降解作用，这表明蛋白酶体降解途径的功能对T3介导的POI敲低至关重要。
在T3在体外表现出有效降解后，利用动物模型全面评估双重PROTAC降解剂的效果。探索 T3 是否也能促进体内α-Syn聚集体和总tau的清除。相关结果显示，T3具有良好的体内外血脑屏障穿透性，在测定了脑内的ADME水平后进行药效学测试，T3分子可以很好的实现对体内的a- syn聚集体和tau的总量的降解。综上所述，作者发现了一系列有效的双PROTAC降解剂，可以同时降解α-Syn聚集体和总tau。该研究结果提供了一系列基于PROTAC靶向α-Syn聚集体和tau聚集体的新型双小分子降解物，这将拓宽基于PROTAC的降解物的应用范围，并可能为神经退行性疾病的治疗提供潜在的治疗策略。
本文作者：LJY
责任编辑：LRC
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.3c01719
DOI：10.1021/acs.jmedchem.3c01719
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