分享一篇近期发表在JACS上的文献，题为：Responsive Organoselenium Dendritic Polymers: From Monodisperse Dendrimers to Self-Assembled Micelles for Advanced Therapeutic Applications，该工作的通讯作者是来自皇家理工学院的Michael Malkoch教授。

    树枝状大分子是唯一能够合成出高度结构完美性的单分散聚合物，从结构角度来看，树枝状大分子是高度支化的分子，具有高密度的外围官能团。其高度的结构精确性导致了结构-性能的一致性。在按性质分类的庞大树枝状体系家族中，聚酯类（特别是基于2,2-双(羟甲基)丙酸 (bis-MPA) 的树枝状大分子）在生物医学研究中获得了相当大的关注。树枝状聚合物的一个有趣应用是将其用作纳米医学中的药物载体。不幸的是，文献中报道的主导数量的树枝状聚合物含有惰性的内部结构，仅利用其外围进行治疗性负载物的修饰。迄今为止，专注于设计异官能聚酯树枝状大分子的研究有限，这些分子中的官能团不仅位于外围，而且沿着树枝状骨架分布。

    硒（Se）作为一种微量元素，它对维持身体的多种功能至关重要，在硒依赖性酶的功能中发挥关键作用，以保持细胞内的氧化还原平衡并预防严重疾病，除了硒基化合物强大的抗癌特性外，与硫相比，其较大的原子半径和较低的电负性赋予硒基聚合物动态性以及对多种刺激的响应性。为了探索新的复合领域，作者提出了一代新型树枝状大分子，将硒可整合到bis-MPA树枝状支架中，成功合成了聚酯树枝状大分子和线性-树枝状 (LD) 聚合物，其硒位于树枝状核或树枝状分支上，同时使外围可用于进一步的修饰（图1）。

图1.含硒bis-MPA树枝状大分子示意图

    首先作者合成了生物活性骨架的含硒Bis-MPA树枝状前药：从粉末状的元素硒出发，合成并充分表征了单分散的bis-MPA树枝状大分子，其中硒以二硒醚和单硒醚的形式被包含在树枝状聚合物的核心或树枝状分支中（图2）。

图2.本工作中合成的含硒 (Se) 树枝状化合物，其中硒被包含在树枝状聚合物的核心（左）或树枝状分支中（右）

    所有合成的化合物均通过NMR光谱 (¹H, ¹³C, ⁷⁷Se)、MALDI-TOF和SEC进行了充分表征（图3）。⁷⁷Se NMR证实了单/二硒醚相对于氧化/还原反应的稳定性，在羟基功能化的二硒醚和单硒醚基树枝状大分子中分别仅在281 ppm（图3A）或121 ppm处出现一个峰，通过SEC分析证实（图3B），两组所有树枝状大分子都具有低分散度值，二硒醚衍生物的MALDI-TOF光谱，显示出归属于二硒醚树枝状大分子的峰，以及一个对应于二硒醚桥断裂产生的硒醇的额外峰。

图3.(A) 第二代二硒醚衍生物 (Se₂-G2-(OH)₈) 在CD₃OD (*) 中的¹H、¹³C 和⁷⁷Se NMR 堆叠谱图。(B) 三代二硒醚基树枝状大分子(Se₂-G1-(OH)4, Se₂-G2-(OH)₈, Se₂-G3-(OH)₁₆) 的 SEC曲线。(C) 在树枝状分支中含有单硒醚官能团的第一代和第二代树枝状大分子 (TMP-G1-(Se)₃-(OH)₆和 TMP-G2-(Se)₆-(OH)₁₂) 的 MALDI-TOF 堆叠谱图。

    随后作者验证了含硒树枝状大分子的稳定性，尽管单硒醚树枝状大分子具有理论更稳定的构型，但观察到由琥珀酸部分存在驱动的水解降解。这种降解在-20°C长期储存后随着树枝状代数的增加而增加。作者在二硒醚树枝状大分子家族中观察到的较高长期稳定性并测试了第三代二硒醚树枝状大分子 (Se₂-G3-(OH)₁₆) 的氧化还原和pH响应性并与二硫醚 (S₂-G3-(OH)₁₆) 以及疏水链 (But-G3-(OH)₁₆)对比。

    由于在肿瘤微环境中，谷胱甘肽 (GSH 10 mM) 的浓度大约是细胞外环境 (~10 μM) 的3个数量级，因此作者在生理pH值7.4和37°C下，测试了在树枝状核心具有动态键的第三代树枝状大分子Se₂-G3-(OH)₁₆和S₂-G3-(OH)₁₆以及对照树枝状大分子But-G3-(OH)₁₆对GSH的响应特性。

    在细胞内条件下，虽然基于S的树枝状大分子的分子峰在30分钟内仍可观察到，但对于Se对应物，在不到15分钟内，就观察到树枝状体系的完全断裂。其还原产物可以观察到显著差异，对于二硫醚衍生物，硫醇的峰在孵育1小时后仍可观察到，但对于二硒醚，它仅在时间零时可见，之后只能识别到归属于不含Se的树枝状分子的峰。相反，在细胞外条件下由于GSH浓度低，两种衍生物的结构几乎保持完整（图4A）。

    而对于pH响应性，在不同生理pH值（4.4、5.4、6.4和7.4）下测试了各个树枝状大分子的稳定性。由于结构中存在酯键，这些树枝状大分子极易水解，pH越高，相同时间内水解程度越高，但核心并未因pH值的变化而改变，解聚从最外层开始发生，逐渐失去所有bis-MPA（图4B）。

图4.第三代二硒醚树枝状大分子 (Se₂-G3-(OH)₁₆)在 37°C 下不同设置的降解研究：(A) pH 7.4和谷胱甘肽 (GSH) 在细胞内 (10 mM, 左) 和细胞外 (10 μM, 右) 条件下，通过 MALDI-TOF 和⁷⁷Se NMR分析。细胞内条件研究在不同孵育时间点进行，最长至1小时；模拟细胞外环境时最长至48小时；(B) 不同pH值 (4.4, 5.4, 6.4, 7.4)，比较时间零与孵育3或4周后的 MALDI-TOF 结果。

    为了展示将硒整合到bis-MPA基树枝状支架中的多功能性，作者还合成了含单硒醚的线性-树枝状 (LD) 聚合物作为概念验证。这些结构融合了mPEG_5k线性链的特性与bis-MPA树枝状支架提供的特性。mPEG提供亲水性和生物相容性，从聚合物链的一端延伸出不同代数的bis-MPA树枝状分子，提供疏水性、生物可降解性、多价性，以及由于嵌入聚酯树枝状骨架中的单硒醚部分而产生的响应行为（图5A）。

    作者合成了羟基功能化的LD (mPEG_5k-Gn-(Se)_m/2(OH)_m, 其中n = 2或3, m = 2或4)，最后通过硒醇-烯点击化学，用烯丙基外围部分进行功能化，作为后功能化的方法验证 (mPEG_5k-Gn-(Se)_m/2(Allyl)_m, 其中n = 2或3, m = 2或4)。并通过NMR (¹H, ¹³C,⁷⁷Se)（图5B）以及SEC（图5C）确认合成聚合物的结构。

作者探究了含硒LD在水环境中的胶束排列，通过动态光散射 (DLS) 分析了聚合物的大小。游离的mPEG_5k-OH在25°C PBS中1和10 mg/mL时的流体力学直径为5 nm，对比第二代和第三代丙酮保护的衍生物：mPEG_5k-G2-(Se)₂(Ac)₂和mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄的以体积（D_v）或数量（D_n）分析的流体力学直径可以观察到，mPEG_5k-G2-(Se)₂(Ac)₂仅为4 nm，说明大部分聚合物保留在溶液中，没有发生组装。而mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄可能发生了自组装，二代可能是源于其树枝状嵌段的疏水性不足无法形成胶束，将丙酮保护替换为烯丙基后，得到的产物无论是二代还是三代（mPEG_5k-G2-(Se)₂(allyl)₄和mPEG_5k-G3-(Se)₃(allyl)₆）通过DLS均观察到了较大的流体力学直径（图5D），但是水溶性降低。

图5.(A) 具有丙酮保护或烯丙基作为外围官能团的第三代含硒线性-树枝状聚合物。(B) CDCl₃(*) 中 mPEG-G3-(Se)₄(Ac)₄ 的¹H、¹³C 和⁷⁷Se NMR。(C) 商业可得的 PEG_5k-OH与合成的第二代和第三代含硒 LD 的 SEC 曲线。(D) 使用蒸发法在 5 mg/mL下获得的含硒 LD 的 DLS 数据。

    作者测量了mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄在0.01至1 mg/mL浓度范围内的表面张力计算出其临界胶束浓度 (CMC)为0.12 mg/mL（图6A），用透射电子显微镜（TEM）观察到mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄的胶束聚集体呈球形（图6B），有趣的事，尽管观察到单硒醚树枝状大分子稳定性较差，但由mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄胶束结构在生理条件下可稳定长达1周，种差异可能归因于它们不同的构型。对于树枝状大分子，硒部分朝外暴露，而在胶束排列中，硒部分指向内部，并可能受到PEG链存在的保护。

    随后作者研究了在氧化应激下含硒 Bis-MPA 基胶束的受控解组装。由于癌细胞中ROS水平高于正常细胞，可能使胶束在癌细胞区域靶向解组装。作者使用0.1% H₂O₂加入到mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄的胶束分散液中并通过TEM（图6B）以及¹H和⁷⁷Se NMR（图6C）分析其行为，NMR证实，加入H₂O₂导致硒部分氧化，引起⁷⁷Se NMR中Se峰从约117.6 ppm移动到850.3 ppm。除了⁷⁷Se NMR外，¹H NMR谱图也显示靠近Se的亚甲基质子信号向低场移动。由于硒原子氧化为硒氧化物或硒砜，胶束的核心变得更亲水，这可能导致其解组装，TEM显示，氧化3小时后，胶束完全解组装，形成小颗粒。¹H NMR信号变得更尖锐。

图6.(A) 从有机溶剂或低于CMC的水性溶剂中的游离LD构型到它们自组装成胶束，再到在氧化应激下解组装。(B) mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄聚合物/胶束在水中的 TEM 图像，浓度分别为0.03 和 0.5 mg/mL，以及用 H₂O₂(0.1%) 处理后的图像。(C) 在(B)指定条件下获得的¹H NMR 和⁷⁷Se NMR 谱图叠加。

    其解组装行为证明了其靶向释放的可行性，因此作者测试了其对细胞毒性的影响，使用CellTiter-Glo发光细胞活力检测法，在树枝状大分子和LD聚合物处理后，对乳腺癌细胞系以及非癌成纤维细胞进行了初步的细胞活力实验，在高达40 μM的各种浓度下，在4T1（小鼠乳腺癌细胞系）或3T3（小鼠成纤维细胞）上未观察到对照树枝状大分子 (S₂-Gn-(OH)_m或 But-Gn-(OH)_m) 的毒性（图7A），而二硒醚树枝状大分子家族 (Se₂-Gn-(OH)_m) 显示出明显的毒性（图7B），对于4T1细胞，第一代二硒醚树枝状大分子的效力最强，IC50值为5.6 μM，显示出剂量依赖性抗癌效应然而，对于第二代和第三代对应物，尽管在类似于第一代树枝状大分子的浓度下达到50%细胞活力，但当浓度高于5 μM时，细胞活力响应不是剂量依赖性的。在这些水平上，浓度的进一步增加并未显著影响细胞活力，在40 μM时，两代的细胞活力都稳定在约40%。因此，无法准确测定IC₅₀值。随后使用MCF-7（人源乳腺癌细胞系）作为额外的乳腺癌细胞系进行细胞毒性测试。在该细胞系中，三代树枝状大分子均显示出剂量依赖性效应，IC₅₀值在4.1至7.6 μM之间，此外，当比较非癌细胞系3T3和癌细胞系MCF-7的细胞毒性时，这些树枝状大分子在癌细胞中表现出更低的IC₅₀值，表明具有一定程度的癌症选择性毒性。需要重点强调的是Se₂-G1-(OH)₄表现出的显著选择性，其在3T3细胞中的IC₅₀值分别是4T1或MCF-7细胞的2倍或1.5倍（图7B）。

    为了了解抗癌活性是否源于二硒醚桥的断裂，将二硒醚替换为单硒醚后，树枝状大分子在高达40 μM时变得无毒，证实了二硒醚键的还原是其抗癌效力主要来源的假设。随后作者测试了作为含硒胶束前体合成的LD在对上述细胞系的毒性在高达40 μM时未观察到毒性，表明其毒性低（图7C）。

图7.(A) 3T3、4T1 和 MCF-7 细胞用二硒醚化合物 Se₂-Gn-(OH)_m (n = 1−3, m = 4−16) 处理 24 小时后的细胞活力百分比。(B)同一二硒醚树枝状大分子家族以及2-羟乙基二硒醚核心 (Se₂-(OH)₂) 的 IC₅₀ 值。(C) 3T3、4T1 和 MCF-7 细胞用含硒丙酮化合物保护的线性树枝状 (LD) 聚合物 (mPEG_5k-Gn-(Se)_m/2(Ac)_m, n = 2或3, m = 2或4) 处理24小时后的细胞活力百分比。

    综上所述，作者通过发散合成方法将Se成功整合到一个基于bis-MPA的树枝状聚合物平台中，范围从单分散树枝状大分子到多分散的LD杂化物。第三代丙酮化合物保护的树枝状聚合物mPEG_5k-G3-(Se)₄(Ac)₄能够在水环境中自组装，根据DLS和TEM测量，形成约20 nm大小的球形胶束，这是针对生物医学应用时所需的尺寸。二硒醚桥键通过二硒醚官能团的还原赋予受控降解能力，这在细胞内条件下比细胞外环境更强。树枝状聚合物中单硒醚的存在使得其胶束在氧化应激下能够受控解组装，这是由于硒原子的氧化所致。此外，这些树枝状结构中酯键的存在使其具有pH响应性，其中pH升高通过从树枝状结构外层到内层的解聚机制促进更快的降解。从生物学角度，引入二硒醚桥键赋予了bis-MPA树枝状体系本身抗癌活性，第一代衍生物Se₂-G1-(OH)₄在体外显示出对癌细胞的有前景的选择性，单硒醚的存在并未改变bis-MPA骨架众所周知的低毒性本质，可作为未来潜在的抗癌药物载体，这些载体会在癌细胞中存在的氧化应激下解组装。

作者：TCM

DOI: 10.1021/jacs.5c00811

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c00811