RNA 不再仅仅是 DNA 和蛋白质之间的"信使"——越来越多的证据表明，RNA 分子（尤其是 lncRNA、circRNA）直接参与蛋白质相互作用，调控基因表达、染色质重塑等关键生物学过程。要研究这些 RNA-蛋白相互作用（RBP），RNA Pull-Down 是最核心的技术之一，而生物素标记则是其中最关键的"捕获工具"。本文系统梳理 RNA Pull-Down 中生物素标记的应用要点。

一、RNA Pull-Down 的基本原理

RNA Pull-Down 的核心思路是：用生物素标记的 RNA 作为"诱饵"（bait），通过链霉亲和素磁珠捕获与该 RNA 相互作用的蛋白复合物，再通过质谱鉴定互作蛋白。

标准流程

1. 体外转录（IVT）合成 RNA：在转录过程中掺入生物素化核苷酸（Biotin-UTP 或 Biotin-CTP）

2. RNA 与细胞裂解液孵育：生物素化 RNA 与蛋白提取物中的互作蛋白结合

3. 链霉亲和素磁珠捕获：磁珠结合生物素化 RNA-蛋白复合物

4. 严苛洗脱：去除非特异性结合蛋白

5. 变性洗脱：SDS 上样缓冲液 95°C 洗脱

6. 质谱鉴定：胶内酶切 + LC-MS/MS 鉴定互作蛋白

二、生物素标记策略选择

Biotin-Streptavidin：Pull-Down 的"金标准"

生物素-链霉亲和素系统的核心优势在于其近乎不可逆的结合——即使在高盐、高浓度去垢剂的严苛洗脱条件下也不会解离，最大限度地去除非特异性结合蛋白，获得高信噪比的互作蛋白。

与其他标记系统的对比

三、关键技术要点

1. 生物素化核苷酸掺入比例

体外转录时，Biotin-UTP/CTP 与未标记 UTP/CTP 的比例需要优化：

• 比例过高：影响 RNA 二级结构，可能导致互作蛋白无法结合

• 比例过低：生物素标记不足，磁珠捕获效率下降

• 推荐起始比例：Biotin-UTP : UTP = 1:2 至 1:3

2. 探针设计策略

3. 蛋白提取策略

4. 非特异性结合控制

• 阴性对照：使用反义链 RNA 或突变 RNA 作为阴性对照

• 竞争性封闭：磁珠预孵育用 tRNA 或 salmon sperm DNA 封闭

• 严苛洗脱：增加 NaCl 浓度和去垢剂浓度

四、2026 年新技术：FISH+

2026 年 6 月发表在 Communications Biology 上的 FISH+ 技术，将 RNA 荧光原位杂交（FISH）与邻近生物素标记相结合：

• 通过将过氧化物酶招募到 RNA 靶点，实现固定细胞内的原位邻近生物素化

• 可同时实现 RNA 可视化和 RNA 互作蛋白鉴定

• 对 XIST 互作蛋白的研究中，成功富集了已知的 SPEN、CIZ1、RBM15 等互作蛋白

• 对 PNCTR（每个细胞约 36 个拷贝）观察到明显的 RNA 点状信号，结合了 RNA 和邻近蛋白的生物素化信号

这一技术为生物素标记在 RNA 研究领域开辟了新的应用方向。

五、纳孚生物对 RNA Pull-Down 研究的支撑

联系我们

纳孚生物 — 专业化合物定制合成与生物素标记服务商