代谢谱分析通常是通过质谱（MS）在反相（RP）和亲水相互作用色谱（HILIC）之后进行的，这些质谱分析是独立进行的（数据集会发生重叠），也可能是耦合配置，需要多个液相色谱（LC）系统。

本篇为2020年5月30日，斯坦福大学医学院在Journal of Chromatography B发表的题“Metabolic profiling by reversed-phase/ion-exchange mass spectrometry”的研究文章，此研究开发了使用反相（RP）-离子交换（IEX）色谱柱串联的单个LC系统的20分钟色谱方法。在临床样品浓度下可以有良好的精密度检测代谢物，并证明了对临床上重要的异构体具有良好的色谱分离效果。

人的代谢组包括脂质，碳水化合物和代谢中间体（例如有机酸，氨基酸和酰基肉碱）。使用液相色谱-质谱法（LC-MS）检测这些种类繁多的化合物目前需要多种色谱技术。通常来说，脂质组学方法使用反相（RP）色谱，亲水相互作用色谱（HILIC）或直接输注。糖组学方法使用HILIC。由于仅基于RP或HILIC的方法可能会丢失关键代谢物，因此通常将这两种方法的独立使用结果结合起来，以通过全扫描MS捕获和检测全部化合物。但是，这种方法需要为每种色谱技术分别准备样品，并导致数据集重叠（即可能有两种技术都检测的代谢物），因此必须精确分析以实现单个唯一的结果集。

尽管目前已经研究了各种色谱策略以解决RP和HILIC独立使用的局限性。这些策略扩大了代谢组学分析的覆盖范围，但它们在不牺牲负模电离的情况下仍无法解决关键的病理组代谢产物（例如，在枫糖浆尿病中见到的异特异亮氨酸）的检测问题。

文章报告了一种新颖的两色谱柱串联方法，其中RP色谱柱位于IEX色谱柱之前。在这种方法中，RP色谱柱捕获弱极性和非极性化合物，而IEX色谱柱捕获带电化合物。

本文描述了方法的发展并介绍了所得的代谢物文库，证明了RP-IEX方法可捕获并解析临床上相关的氨基酸，酰基肉碱和有机酸，并进一步证明了使用人类血浆和尿液样品的分析灵敏度和精密度。这代表了通过单个LC系统扩大临床相关代谢中间体的覆盖范围的重要一步，并为在各种疾病状态下进行其他代谢组学研究铺平了道路。

1.样品和分组

取代谢紊乱患者血浆样本4份，尿液样本3份。样本为常规临床实验残留样本。

2.标准品溶液

混标是由五种有机酸（琥珀酸、甲基丙二酸、甲基琥珀酸、乙基丙二酸、癸二酸， 10μM）、八种氨基酸（谷氨酰胺、肌氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸，50μM）组成的试验混合物，并对硬脂酰肉碱（3.8μM）进行了色谱方法优化和稀释，然后进行分析。

3.代谢物的提取

处理血浆样品时，将50μL样品与150μL沉淀试剂（甲醇：异丙醇：甲酸  v/v/v =2：1：0.1％）涡旋混合，并在3°C下以17,000g离心30分钟。将上清液用水以1：5稀释并进行分析。对于尿液，将50μL样品在3°C下通过超滤（3-kDa）在17,000g下进行10分钟脱蛋白。将滤液用1％甲酸的水溶液（v / v）以1∶2的比例稀释并分析。通过合并上述四个血浆和三个尿液样本，创建了两个质量控制（QC）样品，一个血浆和一个尿液。通过将每个样品（含代谢紊乱的个体样本）按非重复顺序进样五次进样来评估分析精度。

1.色谱方法的开发

此研究实现了两个重要的细节。首先，将混合模式RP-IEX设计去耦可以提高分析性能。例如，IEX色谱柱前的RP色谱柱额定值为18,000 PSI（通常额定值为6,000 PSI）坚固耐用并可以加快运行时间，因为RP色谱柱可以承受更大流速和压力。这使我们能够规定每个色谱柱的长度，从而更好地平衡色谱分辨率与分析速度。较长的色谱柱会延迟RP色谱柱捕获的非极性化合物和IEX色谱柱捕获的高碱性代谢物的洗脱。其次，四元液相色谱系统将是必要的。根据我们的经验，使用混合模式C18-IEX色谱柱进行小分子分离的一篇出版物有力地表明，二元溶剂系统不足以控制两个正交的固定相。需要有机梯度来控制RP色谱柱的洗脱，同时需要挥发性盐梯度来控制IEX色谱柱。

图1 | 异构体的拆分，代谢谱图中常见的异构体的提取离子色谱图

图示可以看出苹果酸发生源内裂解，会干扰富马酸或马来酸的分析

异构体的拆分对于代谢谱分析至关重要。例如，两种5-碳甘氨酸缀合物2-甲基丁酰甘氨酸和异戊酰甘氨酸都需要分离，因为它们代表了支链氨基酸代谢中的不同途径。在另一个例子中，别异亮氨酸需要分离，因为它对枫糖浆尿病是致病的。图1显示了与人类代谢有关的选择异构体的分离。库中提供了其他异构体的分离。

2.获得代谢物本地库

使用可靠的标准品生成了包含397种代谢物的文库。该方法可捕获极性范围广泛的分析物，包括酰基肉碱，氨基酸，胆汁酸，核苷，有机酸，类固醇激素和维生素辅助因子（图2）。因为它基于疏水性和电荷捕获化合物，这两个主要的化学性质决定了保留，所以这种色谱布置可能会保留许多其他化合物。然而，这种方法并未保留糖和具有多个磷酸基团的化合物，但化合物在LC系统中受到痕量金属的不利影响。

图2 | 极性和非极性代谢物的分离

标样的重叠提取离子色谱图表明，可以通过此RP-IEX方法分离的化合物的极性范围广。

3.人体样品的代谢物检测

临床代谢概况分析通常使用血浆和尿液样本进行，这两种样本均含有需要正负电离的代谢物。由于作者的方法不使用离子对试剂，因此可以使用两种电离极性。通过分析具有特定代谢破坏的血浆和尿液样本以及相应的血浆或尿液QC库，评估了临床相关浓度下的总体离子特征检测。根据临床相关的极性和非极性代谢产物（从甲基丙二酸到异丁烯亮氨酸到硬脂酰肉碱）的存在来选择样品。总共血浆和尿液组拥有有效的5,445和4,111个离子特征。

血浆和尿液QC样品中的代谢组学鉴定（使用稀释的浓度的病理性化合物和生理浓度的内源性化合物）的鉴定，使用我们的可靠标准品库分别显示出88种和82种代谢物。此方法可检测代谢物，例如甲基丙二酸，谷氨酰胺，甘氨酸，瓜氨酸，蛋氨酸，别称异亮氨酸，精氨酸，肌酸，肉碱，丙酰肉碱，硬脂酰肉碱，2-甲基柠檬酸，丙酰甘氨酸，2-甲基丁酰甘氨酸，3-甲基巴豆酰亚甘氨酸，己二酸和戊二酸。值得注意的是，血浆样品的最终稀释度为1:20，以反映临床实验室所需的简单，快速的样品处理。尽管有稀释因子，大多数代谢物的峰面积仍在104-106范围内。如果需要更高的灵敏度，则可以采用蒸发步骤。

虽然这种方法不适用于脂质组学应用，但已检测到许多半亲脂性代谢物。硬脂酰肉碱是库中最非极性的代谢中间体之一，保留时间为12.8分钟。因此，为了洗脱其他半亲脂性代谢物，RP再生延长至15.1分钟。对血浆中m / z特征的鉴定搜索在第13分钟到第16分钟之间洗脱，主要是对脂质的初步注释。例如，列出了六种脂质作为特征的潜在注释，其在14.47分钟洗脱，m / z为844.5093。经过五次非顺序重复进样后，此功能的峰面积CV为4.7％（平均峰面积= 29,235），表明洗脱稳定。基于这些观察结果，在第四溶剂通道中使用异丙醇可扩大脂质覆盖率。

4.LC-QTOF方法的数据质量

一致的保留时间和化合物电离对于峰对齐和下游报告质量至关重要。每次进样5次，共进行45次进样，以评估批内分析的精密度。图3显示了所有进样过程中所选化合物的叠加提取离子色谱图，显示了整个采集过程中一致的保留时间和峰面积。内部库生成后至少一个月，保留时间保持在0.5分钟的保留时间范围内，这表明良好的保留时间稳定性。

图3 | 保留时间稳定性，通过将每个样品注射五次来评估保留时间稳定性

本文概述的色谱设计强调了色谱在代谢谱分析中的关键作用。RP-IEX色谱可使用一台LC-MS系统在20分钟内分离出临床上相关的代谢中间体（包括异构体），其极性范围很广。值得注意的是，简单的RP-IEX设置可保留并分离目前需要多个LC系统或独立的RP和HILIC分析的氨基酸，酰基肉碱和有机酸。且每个色谱柱都可以独立控制，并具有协同作用，以增加检测到的代谢物的数量。该方法显示出较高的分析质量，并为人体血浆和尿液样品提供了合适的灵敏度。由于不使用离子对试剂，因此MS系统可用于负极性和正极性。应用方面，LC方法可以与三重四极杆质谱仪结合使用，从而可以提高灵敏度、精度、动态范围和快速的极性切换。

本文探索了反相色谱柱与离子交换色谱柱串联后的单个LC系统，并通过这个系统开发了20分钟的覆盖范围广的LC色谱方法。研究者确定了使用这种串联色谱柱来实现对临床上重要的极性和非极性化合物的分离策略。通过该策略和色谱柱的配置方式，优点：可以无需衍生化或离子对试剂即可实现极性和非极性化合物的分离。

研究者通过这种方法创建了397个真实样本的数据本地库，并对临床血清和尿液样本进行了测试，成功鉴定了88个（血浆）和82个（尿液）代谢物。此研究为高覆盖度LC系统提供了新的策略，在临床相关浓度下以良好的精密度检测了代谢物，并证明了对临床上重要的异构体具有良好的色谱分离效果（包括甲基丙二酸和琥珀酸，以及异亮氨酸和异亮氨酸/亮氨酸）。这篇文章通过方法创新与开发，扩大LC覆盖范围，并获得了良好的分离效果，十分值得借鉴。

部分参考文献：

[1]Gertsman I, Gangoiti J A, Barshop B A. Validation of a dual LC–HRMS platform for clinical metabolic diagnosis in serum, bridging quantitative analysis and untargeted metabolomics[J]. Metabolomics, 2014, 10(2): 312-323.

[2]Gao Y, Chen Y, Yue X, et al. Development of simultaneous targeted metabolite quantification and untargeted metabolomics strategy using dual-column liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Analytica chimica acta, 2018, 1037: 369-379.

[3]Greco G, Grosse S, Letzel T. Serial coupling of reversed‐phase and zwitterionic hydrophilic interaction LC/MS for the analysis of polar and nonpolar phenols in wine[J]. Journal of separation science, 2013, 36(8): 1379-1388.

[4]Opiteck G J, Lewis K C, Jorgenson J W, et al. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins[J]. Analytical chemistry, 1997, 69(8): 1518-1524.

[5]Gingras A C, Gstaiger M, Raught B, et al. Analysis of protein complexes using mass spectrometry[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2007, 8(8): 645-654.

来源：鹿明生物