今天给大家分享一篇发表在ACS Central Science上的文章，题目是Sequential Glycosylation of Proteins with Substrate-Specific N-Glycosyltransferases, 文章通讯的作者是来自于美国西北大学的Jewett教授和Mrksich教授，Jewett教授的研究兴趣是研究蛋白合成和代谢中生物工程系统，包括体外糖蛋白的合成和无细胞代谢工程等。Mrksich教授的研究兴趣方向是利用有机化学、材料和生物化学的方法来研究和控制分子功能。
蛋白质的糖基化是一种重要且普遍存在的翻译后修饰，其与蛋白的稳定性和功能有着密切的关系。然而，活细胞内中蛋白质修饰的糖链的结构和活性是复杂多变的，因此合成特定位点修饰和构型的糖蛋白上对研究其功能和性质极为重要。尽管化学全合成和化学酶法可以合成固定的糖链结构的糖蛋白，但是全合成方法只适合少数较小的蛋白，而化学酶法只能在蛋白上连接1~2各特定的糖链结构。在本文中，作者利用N-糖基化转移酶(N-glycosyltransferase, NGT)的正交特异性发展了一种可以在蛋白质的四个位点进行可控糖基化的策略。
作者首先Carbohydrate Active enZYmes (CAZY)数据库（含NGT和OGT）进行系统进化分析，针对1409个特异性蛋白序列筛选出41个可能的NGTs，随后利用无细胞蛋白质合成体系（cell-freeprotein synthesis, CFPS）合成这些NGT，并通过作者之前建立的GlycoSCORES（self-assembled mono-layers for matrix-assistedlaser desorption/ionization mass spectrometry, SAMDI-MS）方法和6个已知N-糖基化底物检测这些NGT的活性，结合底物的特异性和活性，作者发现EcNGT, HiNGT, ApNGT和ApNGT这四种NGTs具有很高的活性，但是底物的特异性差别很大。随后作者设想是否可以利用这四种NGTs的底物特异性发展一种依次连续四步糖基化的策略，即每一种NGT只在某一步进行糖基化。作者为了实现这种设想，首先对四种NGTs的底物特异性进行研究筛选，糖基化位点的特征序列一般为X−2(X−1NX+1T/S)RC，作者对这个肽段序列（GlycTags）中的X-2、X-1和X-2进行优化，依据糖基化的特异性，找到四个对应具正交性底物序列WYANVT, YMGNIS, LNENVT和 WDYNLT。作者随后进一步在蛋白体系中验证这种连续四步糖基化的策略，作者将这种GlycTags分别插入到E. coli 免疫蛋白Im7中，随后分别通过质谱在肽段、全蛋白质、位点水平验证了每一步糖基化的正交性和可控性。最后作者将建立的这一方法应用在有临床应用的免疫球蛋白上，在该蛋白上恒定区域插入2个GlycTags，在这两个位点实现了连续定量的葡萄糖修饰。
总之，本文利用N-糖基化转移酶的正交特异性实现了在一个蛋白上的多个位点连续可控的糖基化。
本文作者：TH
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acscentsci.9b00021
文章引用：DOI: 10.1021/acscentsci.9b00021
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