跟大家分享一篇今年7月份发表在JACS的文章。文章的题目是：Bicyclobutane{attr}3209{/attr} Amide as a Cysteine-Directed Strained Electrophile for SelectiveTargeting of Proteins（双环丁烷酰胺作为半胱氨酸的亲电试剂选择性靶向蛋白质）。文章的通讯作者：Akio Ojida，九州大学药学研究生院教授，研究方向：荧光成像，新药物开发；Naoya Shindo，九州大学药学研究院助理教授，研究方向：有机化学，药物开发化学。

带有亲电活性基团的小分子可以与蛋白质的亲核氨基酸残基共价结合，实现更强更持久更特异性的对靶向蛋白进行功能调节，提供治疗优势，促进药物开发。最近在靶向共价抑制剂(TCIs)开发方面的成功证明了开发相关蛋白质的不可逆抑制剂的优点；靶向具有致癌性G12C突变的KRAS蛋白的TCIs工作也成功证实共价抑制剂的重要作用。

在TCI设计过程中，亲电基团需保证与目标蛋白质的足够反应活性并尽量减少非目标反应。如图一所示，丙烯酰胺和氯乙酰胺，作为半胱氨酸作用基团，它已被广泛用于发现基于亲电片段筛选的共价配体。然而，氯乙酰胺由于其相当高的反应活性，因存在非靶反应而不适合临床治疗应用。氯氟乙酰胺(CFA)可作为活性较低的α-卤代乙酰胺。通过亲核芳香取代(SNAr)反应与硫醇反应的杂芳香砜和亚砜也被验证为半胱氨酸的亲电试剂。

TCI的反应活性与其固有的亲电性、反应模式、化学选择性、分子形状和共价结合的可逆性有关。因此，引入新型亲电试剂有助于开发具有理想反应特性的共价抑制剂。在药物化学和化学生物学研究中，三或四元环已被用作一类具有应变激活反应活性的独特亲电试剂。文章将研究较少的双环[1 . 1 . 0]丁烷(BCB)衍生物作为亲电试剂。BCB含水条件下稳定，双环丁烷通过桥接碳碳键折叠成一个蝴蝶状，桥头碳被亲核试剂进攻时，会开环。BCB作为半胱氨酸的共价基团在水介质中与肽进行化学选择性反应，但尚未用于活细胞条件下蛋白质的共价靶向。文章提出BCB酰胺作为一种新的半胱氨酸的亲电试剂，用于TCI设计。

图一.半胱氨酸导向的生物偶联反应

根据Wiberg报道的BCB酯的第一次合成,从3-卤环丁烷羧酸酯出发，在催化条件下室温合成不同BCB酰胺化合物。羧酸盐6用于伯胺的酰胺偶联，丙基膦酸酐(T3P)作为缩合试剂获得BCB酰胺10和11，这些产物的低收率归因于BCB环的空间体积大的四元桥头多碳阻碍了6的羰基碳的反应。相比之下，空间位阻小的羧酸盐7与芳族仲胺的酰胺偶联，用双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(LHMDS)处理得到了高产率的BCB酰胺12-14。活化的4-硝基苯基BCB酯9用于与脂肪伯胺和脂肪仲胺的偶联，以提供BCB酰胺15-18。

图二. BCB酰{attr}3131{/attr}

如图三所示，反应动力学数据表明合成的BCB酰胺的反应活性是可调节的，这取决于所连接的EWG。这种反应活性的差异可能是多种因素综合作用的结果，包括BCB环上取代基的电子效应和空间效应。

图三.BCB酰胺与其他亲电试剂的反应活性比较

通过基于凝胶的ABPP方法评估BCB酰胺和其他亲电试剂在活细胞中的蛋白质组范围的反应活性。荧光凝胶图像显示所有探针都以浓度依赖的方式与细胞蛋白反应；丙烯酰胺化合物29和BCB酯化合物26显示出比其他探针高得多的蛋白质组范围的反应活性。这种反应趋势与图三B（与谷胱甘肽的体外反应）实验中观察到的趋势一致。丙烯酰胺化合物29、CFA化合物 30和BCB酰胺化合物11在凝胶中显示出的不同的作用条带，表明每个探针具有不同的蛋白质组反应性。BCB酰胺作为半胱氨酸的亲电试剂，具有中等至弱的反应活性，适合细胞内蛋白质标记，并显示出不同于迈克尔受体和CFA型共价探针的选择性。

图四.炔基化亲电试剂的蛋白质组范围的反应活性

接下来，设计靶向蛋白酪氨酸激酶BTK的共价抑制剂，并评估它们的反应活性，如图五所示。根据已经被FDA临床批准用于治疗B细胞恶性肿瘤的ibrutinib的分子结构，首先合成了一系列BCB酰胺化合物18，33-38。与迈克尔受体探针32(ibrutinib的有效炔基化类似物)显示出强荧光带相比，脂肪族BCB酰胺探针显示BTK带的中度至弱标记。为了提高共价标记的效率，又设计了含有更具反应性的芳香族BCB酰胺的探针化合物39-41，并得到了明显的改善。对其浓度依赖性标记进行了探究，发现化合物40在低浓度下即可与BTK有效作用。竞争标记实验证实了化合物40与BTK的共价结合，且具有不同于ibrutinib的独特的非靶位特征，通过40与丙烯酰胺化合物对激酶靶标EGFR的反应活性的探究，化合物40的较低标记效率意味着40对BTK的高目标选择性。接下来评估开发的附加BCB酰胺的吡唑并嘧啶的生物活性，结果表明BCB酰胺42通过共价修饰Cys481抑制BTK的激酶活性。Ibrutinib是一种非常有效的BTK抑制因子，在体外激酶抑制试验中显示出比42强50倍的活性。然而，在细胞内激酶抑制试验中，这种作用差异降低到8倍。可以发现，42的胞内反应更优越。

图五.BCB酰胺基共价BTK抑制剂的开发。

最后基于SILAC的化学蛋白质组学技术对BCB探针的反应特异性进行了评估。发现探针32和40都富集了目标BTK。化合物32和40富集的蛋白质总数分别为113和50，表明BCB的非靶活性较低，且其靶标结果与先前报道的32个基本一致；一系列BTK探针（同一配体单元上带有不同的半胱氨酸反应性亲电基团，分别为BCB酰胺、丙烯酰胺和CFA，）都与作为主要靶标的BTK反应，但是非靶标条带的模式不同，这表明探针具有独特的蛋白质组选择性。后续实验表明，共价配体的蛋白质组反应活性可以根据所采用的亲电试剂而改变。

这篇文章，介绍了BCB酰胺作为一种新的亲电试剂，能与半胱氨酸硫醇发生化学选择性反应，其反应活性可以调节。BCB酰胺的这种反应活性被成功地用于开发共价抑制剂，与基于丙烯酰胺的探针相比，在人体细胞中对BTK具有更高的靶选择性。文章使用一系列BTK探针进行的化学蛋白质组学研究提供了一种新的观点，即亲电试剂对共价配体的非靶分布的影响。增加半胱氨酸活性亲电试剂的种类将扩大具有所需蛋白质组反应活性的共价抑制剂的范围。这种共价抑制剂的广泛选择将有助于避免特定蛋白质的不必要的非靶标记，并减少非靶的总数。