分享一篇2025年发表在bioRxiv上的预印文章，Fab-arm exchange affects each and all endogenous serum IgG4 evenly¹。该文章的通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J.R Heck教授。

抗体作为人体免疫系统的核心分子，其在治疗性药物中的应用比例正持续增长。除研究最为广泛的IgG1外，人体内还存在其他多种抗体类型（如IgA、IgM）及其亚类（如IgG2、IgG3和IgG4）。其中，IgG4因其独特的生物学特性以及在生物制剂开发中作为重要骨架的广泛应用而备受关注。IgG4最显著的特征是其能够解离为两个半分子，这些半分子还可与其他克隆来源的半分子发生交换，从而形成新的双价抗体（图1AB）。然而，由于缺乏能在克隆水平上精确解析IgG4分子结构的分析方法，针对内源性IgG4的深入研究一直面临重大挑战。

基于此，本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的创新方法，用于选择性分析体液中内源性IgG4抗体的克隆特征（图1C）。该方法首先从微量样本（约100μL血清）中富集IgG4抗体群体，随后利用靶向铰链区的IdeS蛋白酶进行酶切，释放IgG4（Fab2）结构域。这一关键步骤完整保留了抗体的天然VH-VL配对及互补决定区（CDR）。酶切产物分析显示，洗脱液中同时存在Fab2和Fab片段。通过尺寸排阻色谱（SEC），作者直接比较了初始样本中共价结合与非共价结合IgG4抗体的组成差异。综合实验数据证实，Fab臂交换是一个在体内随机发生的过程，且对所有内源性IgG4抗体的影响程度均等。正是由于这一特性，血清中IgG4抗体的多样性远高于其他IgG亚型。

图1 IgG4的结构特征及其克隆谱系分析方法

为解析IgG4可变区特征，研究者采用middle-down蛋白水解策略。选用可切割所有IgG亚类的IdeS蛋白酶，该酶特异性作用于铰链区下方，释放完整Fab2片段。使用靶向CD20的7D8单抗（IgG1-4亚型）进行比较分析。SEC-UV结果显示：IgG1-3仅产生98kDa Fab2片段，而IgG4同时产生98kDa Fab2和49kDa Fab片段（图2A），这与IgG4铰链区二硫键异构体结构相关（图1B,2B）。血清样本分析进一步证实，内源性IgG4存在Fab2/Fab双群体（图2C），该特征在Natalizumab和DNP-G2a2-IgG4单抗中同样存在（图2D）。基于上述发现，研究者对7名健康志愿者（5女2男，30-60岁）的IgG4库进行分析。其中2号供体在16个月内7次采样，用于纵向研究。所有供体数据显示Fab2与Fab比例稳定为4:1（均值77.6%±3.9%，范围70.7-83.9%），表明血清IgG4更倾向共价结合（图2D）。三种单抗的Fab2占比（均值87.9%）略高于内源性IgG4。

图2 采用SEC-UV技术分析IgG4结构异构体

随后，作者采用LC-MS技术分析了SEC分离的Fab2（98kDa）和Fab（49kDa）组分。在Fab组分中，每位供体可检测到数百个克隆，其多样性与既往IgG1研究一致。但Fab2组分几乎检测不到完整蛋白信号。虽然Fab2分子量较大，但对照实验证实IgG1的Fab2仍可检出数百克隆，排除了分子大小的限制因素。通过化学还原处理，作者发现Fab2和Fab组分都能产生相似的轻链（Lc，23kDa）和重链可变区（Fd，25kDa）。这表明血清IgG4普遍发生了Fab臂交换，导致Fab2组分过于复杂而难以检测。具体而言，n个Fab克隆经Fab臂交换可产生n(n+1)/2种Fab2组合。例如300个Fab克隆理论上形成45150种Fab2分子，使单个Fab2的丰度降低约1000倍，超出LC-MS检测限。还原处理成功将复杂的Fab2组分简化为可检测的Lc/Fd片段，实现了供体间和时序的IgG4克隆谱比较。

通过对7名健康供体（包括2号供体在7个时间点的系列样本）血清IgG4的Fab2和Fab组分进行系统比较分析，作者获得了重要发现。首先，同一供体内还原处理后的Fab2与Fab组分在克隆组成和片段丰度上表现出高度一致性（图3A-B），这直接证实了Fab臂交换在体内是完全随机发生的生物学过程，不存在克隆选择性差异。其次，2号供体超过一年时间跨度采集的系列样本显示出高度保守的IgG4克隆谱系特征（图3C），这一发现表明血清IgG4克隆具有异常的长期稳定性，其持续时间显著超过IgG4已知的21天半衰期。此外，不同个体间的IgG4克隆谱比较显示极低的重叠度，揭示了IgG4抗体库具有显著的个人特异性。

图3 IgG4抗体谱分析为血清IgG4组成特性研究提供了独特视角

IgG4作为人体四种IgG亚类中含量最低但具有重要治疗价值的成员，因其独特的Fab臂交换能力而备受关注。本研究通过创新性的内源性IgG4抗体库分析技术，系统揭示了这一特殊抗体的关键特性。研究发现，IgG4因其易还原的铰链区和较弱的CH3相互作用，能够通过Fab臂交换产生惊人的分子多样性——数百个克隆可随机组合形成数万种不同的分子变体。定量分析显示，约80%的内源性IgG4以共价结合的全分子形式存在，20%为非共价形式，且这一比例在个体间和个体内保持稳定。研究首次证实Fab臂交换是一个普遍且完全随机的过程，与轻链类型无关，同时发现个体IgG4库具有独特的"免疫指纹"特性。这些发现不仅深化了对IgG4动态平衡机制的理解，也为相关疾病研究和治疗应用提供了重要基础。值得注意的是，当前治疗性IgG4抗体常用的S228P突变虽然能抑制Fab臂交换，但也使其丧失了天然IgG4的特性，这一发现对生物药物开发具有重要启示意义。

原文：Fab-arm exchange affects each and all endogenous serum IgG4 evenly