分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章, Development of a Thiol−ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)¹。文章的通讯作者是哥本哈根大学药学系的Kasper D. Rand教授。。

图1.HDXchip结构和装置示意图。 

作者考察了在0 ℃和-20 ℃分别采用在线和离线Quench时，标准多肽(包括缓激肽、血管紧张素Ⅱ、亮氨酸脑啡肽)以及胰岛素的回交情况。结果表明，在-20 ℃快速洗脱模式下，标准多肽的回交率大幅降低(图2)：血管紧张素II为-7.4%(负值表明部分氨基酸侧链保留氘标记)，缓激肽为-27.6%，亮氨酸脑啡肽为8.9%，远优于商用UPLC系统的30-50%。同时，在线Quench相比离线Quench进一步将回交率降低约5%，凸显出了超低温控制的优势。

图2.标准多肽和蛋白质在0 ℃和-20 ℃下的回交情况。

为了验证HDXchip在HDX-MS实验中的有效性和可靠性，作者对胰岛素、泛素和β-乳球蛋白进行了整体HDX-MS分析。结果显示三种蛋白质的氢氘交换动力学曲线具有良好重复性，其氘标记量随时间逐渐增加，符合折叠蛋白的预期构象动态行为(图3)。胰岛素和泛素在分析过程中的平均回交率分别为17.9%和18.6%，显著低于传统UPLC-HDX系统的回交率(30-50%)。这一结果验证了HDXchip在复杂样本中同步分析完整蛋白的能力，同时凸显了其在保持低回交率、高效脱盐及良好信噪比方面的技术优势。

图4.通过 HDXchip 对血红蛋白进行的局部 HDX-MS 分析。(A)来自 Hbα 的分析肽段的合并提取离子色谱图。(B)来自 Hbα 的整理后的 HDX-MS 数据覆盖图(24个肽段，97.2%覆盖率，和 3.59冗余度)。。(C) 来自 Hbβ 的整理后的 HDX-MS 数据覆盖图(13个肽段，87.8%覆盖率，和1.82冗余度)。 (D)来自Hbα 的肽段2−30 的时间分辨HDX-MS 数据。(E) 来自Hbβ 的肽段33−42 的时间分辨 HDX-MS 数据。

总的来说，本文主要研究了微流控芯片在HDX-MS中的应用，通过设计集成固定化酶柱和反相色谱模块的芯片，并利用珀尔帖模块冷却，显著降低了回交，提高了HDX-MS分析的准确性和灵敏度。本研究首次在微流控芯片上集成HDX-MS全流程(酶解、分离、超低温控制)，以低成本方案突破氘保留率瓶颈，为蛋白质动态结构研究与药物开发提供了革新性工具。美中不足的是，虽然该研究在HDX-MS微型化与低温控制上取得了重要突破，但文章也提到了芯片的色谱峰容量仅4.5，导致肽段共洗脱和离子抑制现象严重，影响复杂样品的分辨率和灵敏度。作者归因于芯片流道设计(如出口90°转角破坏层流)，但未提出有效改进方案。显然，芯片的分离性能、酶稳定性和实际通量仍需优化，未来需平衡“集成化”与“功能性”，通过多学科交叉(如材料学、微流控工程、蛋白质化学)推动其向实用化发展。

撰稿：陈凤平

编辑：李惠琳

文章引用：Development of a Thiol−ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)