分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为“Molecular recording of cellular protein kinase activity with chemical labeling”。文章的通讯作者为德国马克斯·普朗克医学研究所的Kai Johnsson教授和De-en Sun博士。Johnsson教授的研究兴趣集中在活细胞中蛋白质的特异性标记，其开发的代表性技术包括 SNAP-tag 和 CLIP-tag等。

蛋白激酶介导的信号级联在几乎所有细胞过程中都至关重要，例如，蛋白激酶A（PKA）是主要的cAMP效应器，其整合了神经调节（neuromodulation）、代谢和增殖等多条信号通路。测量蛋白激酶的活性具有重大的意义，例如PKA的活性水平可作为大脑内神经调节的重要指标。然而，目前通用的方法仍依赖磷酸化抗体分析单一时间点处蛋白激酶底物的磷酸化水平，具有较低的灵敏度和定量能力。人们也开发了一些一些基因编码的、基于荧光信号的蛋白激酶活性报告器，尽管它们实现了时空分辨的蛋白激酶活性定量，但它们仍受限于光学信号的可及性和穿透性，且在操作上存在困难。本文中，作者开发了一种基于激酶活性依赖性蛋白标记的split-HaloTag记录方法，称为Kinprola。该方法可将瞬时的激酶活性转化为永久的化学标记信号，从而记录激酶活性水平。

2024年，作者团队在Science上报道了一种称为split-HaloTag的系统（Science 2024; 383(6685): 890-7），它以两段无活性的HaloTag片段存在，仅当响应特定细胞生理事件时才结合为完整的HaloTag，从而可以被荧光配体所标记。本文中，作者将此技术应用于激酶活性依赖性的蛋白标记。记录器Kinprola PKA包含截短的HaloTag（cpHaloΔ）和一段能与cpHaloΔ结合而使其恢复活性的十肽（Hpep），两者之间通过FHA1结构域和一段PKA底物肽（PKAsub）连接。当PKAsub未被磷酸化时，cpHaloΔ和Hpep之间互相远离，记录器无法被氯代烷标记；而当PKAsub被磷酸化后，FHA1与磷酸化位点特异性结合，导致记录器构象变化，允许cpHaloΔ和Hpep结合称为完整的HaloTag，从而可以被氯代烷标记。通过这种精巧的设计，Kinprola PKA可以记录PKA的活性并将其转化为化学标记信号。作者通过筛选和优化，确定了记录器各组件的序列和连接方式，使其在体外能够显著区分PKA活性的有无——在活性PKA存在时，记录器被荧光氯代烷标记的速率提高1000倍以上，二级速率常数达到1.37 × 10^5 M-1s-1，且这种作用依赖于PKAsub中的磷酸化位点的存在。在确定了这种记录器设计后，作者将Kinprola PKA表达在细胞中，并证明其可在活细胞中记录各种已知条件诱导的PKA活性增强。此外，将连接子上的PKA底物肽替换为其他蛋白激酶（如PKC、JNK和AMPK）的底物肽，也可实现对其他蛋白激酶的响应。

随后，作者通过数个实例强调了这种PKA活性记录器在生物学研究中的重要应用潜力。在第一个例子中，作者在胶质母细胞瘤细胞 （GBC）患者来源的细胞中过表达了Kinprola PKA，在荧光标记后，通过流式分选将细胞按PKA活性分为高、中、低三组，并分别对它们进行了RNA-seq分析。结果显示，三组细胞在转录组水平可以被清晰地区分，尤其是细胞周期和细胞外基质相关的基因转录水平存在显著差异。

在第二个例子中，作者利用Kinprola PKA联合CRISPR-Cas9技术鉴定PKA活性的未知调节因子。作者在稳定表达Kinprola PKA的细胞株中进行CRISPR-Cas9敲除筛选，将敲除后的细胞池同样按PKA活性分为3组。通过此策略，作者成功鉴定到了一些已知的PKA活性调控因子，也鉴定了一些此前未被报道参与PKA调节的新因子，并通过体外实验证明了它们对PKA活性的影响。

最后，作者证实了该技术也可被应用在原代细胞和活体动物中，实现PKA活性变化的记录，并初步研究了小鼠双侧伏隔核中神经调节诱导的PKA活性变化。总结而言，本文基于split-HaloTag技术开发了一种蛋白激酶活性的记录器，其可将蛋白激酶的活性历史转化为永久的化学标记信号，实现对蛋白激酶活性的记录。

本文作者：TYC

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41589-025-01949-6

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01949-6