点评 | 戈惠明（南京大学），雷晓光（北京大学）
{attr}3137{/attr}是指具有环状过渡态的协同反应，这类反应在天然产物的有机合成中常常被应用于一步构建多个碳碳键，而且具有较好的立体选择性和区位选择性。酶的周环选择性(periselectivity)是指反应物可能发生两类或以上的周环反应，但在特定酶的催化下，反应物更倾向于产生某一类周环反应的产物。最近，催化周环反应的酶(以下称为周环酶)作为酶学研究的一个热点，吸引了许多研究者的关注【1】。
2020年9月30日，加州理工大学洛杉矶分校(UCLA)的唐奕课题组、Kendall N. Houk课题组与中科院上海有机所的周佳海课题组合作在Nature上发表了文章An enzymatic Alder-ene reaction，首次表征了自然界中催化Alder-ene反应的酶及其催化氧杂Diels-Alder（DA）反应的同源蛋白。他们根据晶体信息和计算指导，通过定点突变实现了周环选择性的逆转，并深入讨论了两种酶如何利用几乎相同的活性位点实现周环选择性的精准控制。
根据之前唐奕课题组报道的真菌天然产物leporin C的生物合成途径【2】，他们推测在天然产物pyridoxatin (1)和cordypyridone (2)的生物合成途径中，核心部分烯基环己烷砌块可能是由活性中间体quinone methide(以下简称为QM)【3】通过Alder-ene反应产生的；而天然产物asperpyridone A (3)和fusaricide (4)中的吡啶酮核心砌块，可能是由活性中间体QM (7)也可发生氧杂DA反应产生的。通过分析pyridoxatin和fusaricide的生物合成基因簇【4,5】，他们发现都含有编辑O-甲基转移酶(以下简称为OMT)的基因(adxI/epiI)。鉴于之前周环酶LepI的序列和OMT也具有较高的序列同源度，因此他们推测AdxI和EpiI都是潜在的周环酶。另外，在其他真菌菌株中，也存在与AdxI和EpiI同源的OMT，包括PdxI、ModxI、UpiI和HpiI。
体外测活实验发现在PdxG和辅酶NADPH的存在下，化合物5的C7上的羰基可以被还原成羟基，羟基产物6也可以自发地发生O4-杂DA反应和Alder-ene反应，产物比例为3:1。当5和PdxG、NADPH以及AdxI/PdxI/ModxI共同孵育时，主要生成Alder-ene产物8(>98:2, 8:9)；但与EpiI/UpiI/HpiI孵育时，主要产物为O4-杂DA产物9(<5:95, 8:9)。这说明以上六种酶均可以催化脱水反应生成(Z)-QM (7)，但接下来催化的反应具有不同的周环选择性，AdxI/PdxI/ModxI催化的是Alder-ene反应，EpiI/UpiI/HpiI催化的是氧杂DA反应。计算表明，在自发状态下，Alder-ene反应的能垒更高，所以在未加入酶的时候，化合物7主要生成的是氧杂DA反应的产物，但在PdxI等酶的催化下主要产物却为Alder-ene产物。为了深入理解酶催化的Alder-ene反的机理，他们解析了PdxI的母体结构以及与底物类似物5和产物8的复合物晶体结构。复合物的晶体结构和母体结构极为相似，说明底物结合并没有引起蛋白构象较大变化。PdxI-5复合物结构的结合口袋中，吡啶酮环与H161、Q412和K337有直接的氢键作用，与T232间接通过一个水分子形成氢键作用。化合物5的长侧链处于伸展的状态，并没有呈现预组织构象。化合物5作为底物类似物，C7上的羰基和C4上的羟基朝向同一个方向，这表明K337作为一般碱进行催化的脱水反应立体选择性为syn式，因此产生的是(Z)式脱水产物。突变体K337A导致酶失去脱水活性也进一步验证了K337在脱水反应中的关键作用。鉴于K337是作为碱来催化脱水反应的，所以他们在分子动力学模拟(以下简称为MD)的模型中把K337的侧链模拟成铵根离子。在500ns的MD中，底物的侧链在50-100ns时会形成预组织构象。在所有的MD中， K337与7中C4上的羰基的氢键时间最为持久，这说明质子化的K337可能是通过氢键催化来促进Alder-ene反应的。他们还通过残基部分侧链的理论酶(theozyme)模型来研究K337和H161氢键作用对反应速率的影响。使用甲基铵根离子来模拟K337，咪唑阳离子来模拟H161，计算结果显示Alder-ene反应经过TS-4的能垒在酶的促进下降低了11.7 kcal/mol，即速率加快了108。这很可能是因为酶对C4上羰基的质子化导致C7高度亲电，降低了C4羰基氧的亲核性，这也抑制了O4-杂DA反应的过渡态(TS-4)。这个理论酶模型还揭示了经过TS-5的O2-杂DA反应比O4-杂DA反应更有利，但化合物11在PdxI体外酶活实验中并未观察到。将TS-6对接到PdxI中，可以发现T232与TS-6的C14有着位阻作用。T232相当于一面位阻墙，阻止了TS-6构象的形成。为了验证这个假设，他们使用T232A/S突变体进行体外测活实验，果然观察到了化合物11的产生。PdxI中的关键残基K337在EpiI/HpiI/UpiI中是保守的，但EpiI/HpiI/UpiI催化的是O4-杂DA反应。为了解释EpiI/HpiI/UpiI的催化机理和周环选择性，他们解析了apo-HpiI和HpiI-5的晶体结构。Apo-HpiI和apo-PdxI高度相似，HpiI-5和PdxI-5结构中，除了PdxI的V413和HpiI的M415，活性口袋其他氨基酸都是保守的。这个残基位于吡啶酮环结合位点的下方，与PdxI中的K337和HpiI中的K339邻近。HpiI-5的复合物结构清楚地表明了K339与吡啶酮C4上的羟基没有氢键作用。突变体K337A也保留了80%的催化活性，而且周环选择性和野生型是一样的。因此，HpiI催化的反应并不需要C4羟基与蛋白之间的氢键作用。从HpiI的晶体结构还可以看出，这个氢键的消失是由于M415的位阻压迫，导致K339的侧链远离底物。同样的，EpiI和UpiI中该甲硫氨酸都是保守的，而AbxI和ModxI的缬氨酸也是保守的。在晶体结构信息的基础上，他们探究了PdxI的周环选择性能否通过将V413突变成位阻较小的氨基酸发生变化，发现将V413突变成位阻比甲硫氨酸小的丙氨酸或丝氨酸，可以保留PdxI催化Alder-ene反应的活性；而突变体V413M可以将不同周环反应的产物8与9的比例从>98:2变为40:60。相反，将EpiI的M411突变成位阻较小的缬氨酸或半胱氨酸可以将产物比例(8:9)从5:95变为25:75。M411的突变并不能完全改变周环选择性，这说明其他残基对周环选择性也有贡献。从HpiI-5的复合物结构可以推断，底物7的构象灵活性受M411和T231控制的。EpiI突变体T231A/S能提高底物的构象灵活性，使其能和K338形成氢键，有利于Alder-ene反应的发生。T231A/S的确提高了Alder-ene产物8的比例，也提高了O2-杂DA产物11的比例。有趣的是，双突变体M411V/T231A逆转了周环选择性，主要产物变成了Alder-ene产物(66:33, 8:9)。其他减小位阻的突变体M411V/T231S, M411T/T231A, M411C/T231A, M411G/T231A都有相同的周环选择性。因此，将M411和T231变成更小的残基后可以扩大酶的活性口袋，让底物7的构象更有利于C4羰基的质子化，从而导致了周环选择性的改变。结合生化实验、晶体结构和计算结果，他们确证了PdxI/AdxI/ModxI可以催化立体选择性的syn-脱水和接下来的Alder-ene反应，且反应是具有立体、区位和周环选择性的。EpiI/UpiI/HpiI催化的同样是syn-脱水，但接下来催化的是氧杂DA反应。以PdxI和EpiI为代表，PdxI利用K337通过氢键催化促进能垒较高的Alder-ene反应，但在EpiI中，活性口袋中的M411使K337与底物的氢键作用失去所以主要发生O4-杂DA反应。另外，PdxI中的T232和EpiI中的T231有位阻效应，控制了氧杂DA反应的区位选择性，抑制了O2-杂DA产物11的形成。PdxI/AdxI/ModxI、EpiI/UpiI/HpiI这两组同源性的周环酶，因为进化上的细微分歧导致了不同的周环选择性，产生了不同的天然产物。这一工作不仅加深了对周环反应酶的催化机制理解，也为探索催化Alder-ene反应和杂DA反应的新型生物催化剂提供了新的启示。唐奕课题组的博士后Masao Ohashi、博士生Cooper S. Jamieson和周佳海课题组的博士生蔡毓娟并列论文第一作者。该工作中晶体衍射数据是在上海光源BL17U1和国家蛋白质设施BL18U1 、BL19U1收集的。周环反应是一类同时伴随化学键断裂和形成的协同反应，其反应过程中并不产生自由基或离子等活性中间体，一般只需要加热或光照，即可分别产生高度立体选择性的产物，是高度空间定向反应。在有机合成中通常利用周环反应构建C-C键或C-杂原子键以形成高度立体选择性产物。自2011年刘鸿文课题组首次鉴定出能够催化Diels-Alder（DA）反应的周环酶SpnF后，世界各地科学家先后从多种天然产物的生物合成途径中鉴定出了新型DA酶，譬如，在pyrroindomycins生物合成中能够级联催化两步DA反应的PyrE3和PyrI4 (Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 259)；可催化高阶[6 + 4]环加成反应的StmD (Nature 2019, 568, 122)；可以催化逆电子需求DA反应的LccD (J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 5659)；甚至在聚醚合成途径中也发现了意料之外的可催化逆电子需求杂DA反应的Tsn15 (Nat. Catal. 2019, 2, 1045)。前期，加州大学洛杉矶分校(UCLA)的唐奕课题组，鉴定出一种SAM依赖的多功能周环酶LepI，能够同时催化分子间DA反应、杂DA反应和逆克莱森重排反应(Nature 2017, 549, 502)。随后通过上海有机所周佳海课题组解析了LepI与不同底物的高分辨共晶数据，结合Kendall Houk课题组的理论计算工作，系统地阐述了LepI催化的分子机制(Nat. Chem 2019, 11, 812)。虽然近十年间周环酶被不断发掘和鉴定，然而如何控制其发生的反应类型和立体构型仍然是一个难点。近日，唐奕课题组、Kendall Houk课题组与周佳海课题组合作，以LepI为基础，鉴定出6个类似蛋白，结合各自天然产物结构推测，部分可催化Alder-ene反应，另一部分可催化氧杂DA反应。通过体外酶学发现并验证三个酶可加速催化生成Alder-ene的产物，而其余三种酶可加速催化生成与LepI类似的氧杂DA反应。通过PdxI晶体结构解析和酶动力学模拟，发现K337可作为general base来催化脱水反应，它的突变导致脱水活性丧失，此外底物中吡啶酮环与H161和K337的氢键作用使得能垒降低了11.7 kcal/mol，并朝向Alder-ene方向进行。同时计算表明，反应过程中O2-杂DA反应比O4-杂DA反应更有利，通过将T232突变成A/S以降低空间位阻，成功地观测到11的产生。然而在其他催化O4-杂DA反应的酶中，该关键残疾K337是十分保守的，为进一步解释周环选择性，通过对Hpil的晶体结构解析，发现其与PdxI高度相似，仅在PdxI的V413残基对应位置变成了M415，正是由于该氨基酸残基的改变，增加了空间位阻使得K339远离底物，无法形成氢键。将V413突变成比甲硫氨酸小的残基可保留Alder-ene反应活性，突变成甲硫氨酸则使得不同周环反应产物比例从>98:2变为40:60。相反，在Hpil中单一降低M411的位阻并未逆转周环选择性，而将此前具有位阻效应的T231进行突变，产生M411V和T231S双突变株后则逆转周环选择性，使得主产物变为Alder-ene产物。该研究不仅进一步拓展了周环酶的反应选择性，其催化机制的清晰阐明和反应选择性的改造为后期应用奠定了基础。随着对周环酶的不断深入理解，其在天然产物生物合成途径中的重要性与日俱增。
雷晓光（北京大学化学与分子工程学院教授，北大-清华生命科学联合中心高级研究员）周环反应常常被用于碳-碳键的构造，在化学合成中具有重要的应用价值。在天然产物生物合成途径中，周环反应扮演着重要的角色，它能一步构建多个手性中心，迅速提高天然产物结构的复杂度，挖掘自然界中存在的能够催化周环反应的酶对于理解天然产物生物合成途径以及设计复杂天然产物的高效和精准合成的新方法具有重要的作用，因此，越来越多的科学家关注到这一领域。目前，已经报道的周环反应酶（pericyclase）包括[4+2] pericyclases (例如,SpnF, MaDA), [6+4]/[4+2] bispericyclases (例如 NgnD)，copeases(例如FamC1)，但自然界中是否存在催化Alder-ene反应的酶还未见报道。2017年唐奕课题组在黄曲霉（Aspergillus flavus）中鉴定出天然产物leporin的生物合成基因簇，其中SAM依赖酶LepI催化了包括氧杂-Diels-Alder反应在内的多个周环反应。通过基因组挖掘，在其他几种真菌中也能找到类似的基因簇，但不同基因簇产生的天然产物骨架结构并不相同。在天然产物fusaricide的生物合成过程中涉及到氧杂-Diels-Alder反应，而天然产物pyridoxatin的骨架则是由Alder-ene反应参与形成的。基于作者前期对酶催化氧杂D-A反应的理解，他们认为这两类天然产物生物合成过程中的环化反应是由基因簇中O-MT-fold enzymes催化的。基于此假设，唐奕课题组对生物合成基因簇中的O-MT-fold enzymes进行了外源表达和功能验证，他们发现，尽管这些蛋白具有很高的序列相同性，但在功能上可以分为两类：PdxI, AdxI, ModxI催化了Alder-ene反应，EpiI, UpiI, HpiI催化氧杂-D-A反应。为了理解这些同源蛋白如何控制周环反应的选择性，上海有机所的周佳海课题组解析了Alder-ene反应酶PdxI以及氧杂D-A反应酶HpiI的apo晶体结构，同时他们也得到了这两个酶与底物类似物以及产物的共晶结构。在此基础上，Houk课题组对Alder-ene反应酶PdxI催化体系进行了DFT理论计算、分子对接以及动力学模拟，揭示了K337通过与底物形成氢键相互作用降低了Alder-ene反应所需的活化能，使得环化朝着Alder-ene反应的方向进行。在氧杂D-A反应酶HpiI与底物的共晶结构中，虽然HpiI相应的赖氨酸K339非常保守，但是并不能与底物形成氢键，因此氧杂-D-A反应的活化能低于Alder-ene反应的活化能，所以HipI可以选择性地催化氧杂-D-A反应。通过比较这两种不同的周环反应酶，作者发现PdxI和HpiI的活性空腔仅有一处氨基酸残基不同，PdxI中的V413在HpiI中是M415。通过与其他的周环反应酶进行序列比对，作者发现V413在Alder-ene反应酶中是保守的，而M415在所有的氧杂-D-A反应酶中是保守的。因此作者推测，该位点可能控制了周环反应酶的选择性。随后，通过将PdxI中V413突变成体积更大的M，作者发现PdxI的功能发生了改变，从特异性催化Alder-ene反应的进行变成主要催化氧杂-D-A反应的发生，从而证明了V413控制了该类周环反应酶的Alder-ene反应选择性。同样，在HpiI中将M415突变成体积更小的V，HpiI催化Alder-ene反应的能力大大提高。由此，作者证明了该位点对于这类O-MT-fold enzymes控制周环反应的类型至关重要。与此同时，作者还发现氧杂-D-A反应酶EpiI 中T231可以稳定底物构象，阻碍K338与底物形成氢键，从而促进氧杂D-A反应的进行。总之，通过比较产生不同骨架天然产物的生物合成基因簇，作者在真菌中找到了一类全新的周环反应酶，这类酶利用相同的生物合成中间体，精准控制周环反应的类型，从而实现天然产物的结构多样化。通过基于蛋白结构的分子动力学模拟以及突变实验，作者阐明了这类酶的催化机制，也为设计和应用催化Alder-ene反应和杂DA反应的新型生物催化剂提供了新的启示。该工作是天然产物生物合成以及新机制酶学研究领域的一项重大科研突破，将为多环化合物的高效、精准合成提供新的酶催化工具。https://doi.org/10.1038/s41586-020-2743-51.Ohashi M, Jamieson C.S., Cai Y., Tan D., KanayamaD., Tang M.C., Anthony S.M, Chari J.V., Barber J.S., Picazo E., T.B. Kakule,Cao S., Garg N.K., Zhou J., Houk K.N., Tang .. (2020) Discovery of enzymatic Alder-ene reaction and origins of catalytic selectivity. Nature, in press.
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