半乳糖氧化酶(GAO)在生物传感器、酶促合成和诊断中具有广泛的应用。在催化反应中GAO的一个显著特征是其活性中心包含了一个与Cu(II)结合的Cys-Tyr•{attr}3151{/attr}辅因子，其酪氨酸自由基会直接与铜中心配位。
图片来源：J. Am. Chem. Soc.
Cu(II)自由基辅因子可对伯醇进行选择性氧化反应，反应过程中，被还原的Cu(I)-(Tyr-Cys)则再通过氧气的双氧化，再被氧化为活性的Cu(II)-(Tyr•-Cys)状态。
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其中，交联的硫醚键的形成是伴随着Tyr272上的C-H键断裂，这个部分在迄今为止却还没有研究进行探讨。最近，The University of Texas at San Antonio的Aimin Liu教授在J. Am. Chem. Soc.上报道了经由将3,5-二氯酪氨酸（Cl2-Tyr）和3,5-二氟酪氨酸（F2-Tyr）进行遗传掺入，以取代GAOV中的Tyr272。他们发现这两种具有非天然酪氨酸残基的蛋白质仍具有催化能力。且经由确定了GAOV，Cl2-Tyr272和F2-Tyr272结合变体的高分辨率晶体结构表明，辅因子中仅残留一种卤素，表明在辅因子生物发生的自催化过程中发生了氧化的碳-氯/氟键断裂过程。
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该研究使用羟基脲作为自由基清除剂，并通过EPR光谱观察到了自旋耦合的隐藏Cu(II)物种。因此，具有遗传非天然酪氨酸取代的结构定义的催化中心，与野生型GAO一样都含有自由基的形式，即Cu(II)-(Cl-Tyr•-Cys)或Cu(II)-(F-Tyr•-Cys)。这些发现也同时说明了以前由单核铜中心介导的C-F / C-Cl键的裂解过程。
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参考文献：Formation of Monofluorinated Radical Cofactor in Galactose Oxidase through Copper-Mediated C−F Bond Scission
J. Am. Chem. Soc. 2020, doi.org/10.1021/jacs.0c08992
原文作者：Jiasong Li, Ian Davis, Wendell P. Griffith, and Aimin Liu*
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