近日，加州大学旧金山分校著名化学生物学/药物化学家Jack Taunton教授在Nature Chemistry杂志上发表文章“Direct mapping of ligandable tyrosines and lysines in cells with chiral sulfonyl fluoride probes”。Taunton lab长期致力于开发共价抑制剂和可逆共价抑制剂，以及探索天然产物生物活性的分子机制。本文第一作者为Taunton lab博士后陈影，是北京大学化学与分子工程学院王初课题组的博士毕业生。
亲电小分子探针或共价配体是用于研究蛋白质功能和定量分析靶点结合的有效工具，其中半胱氨酸作为最活泼的氨基酸成为了共价配体开发的主要靶向氨基酸。然而，细胞中很多蛋白的配体结合口袋都缺乏邻近的半胱氨酸，这极大地限制了共价配体的开发。酪氨酸和赖氨酸更频繁地出现在配体结合口袋中，同时也具有一定的亲核性，因此成为了共价配体开发的新方向。目前已经有多个靶向赖氨酸或酪氨酸的共价抑制剂被开发。基于骨架的配体筛选策略与定量蛋白质组学的结合已经被较为广泛地应用于鉴定蛋白质组中的可靶位点。此前的方法对可靶位点的解析通常是基于配体骨架对于特定氨基酸靶向探针的竞争作用，是一种间接的鉴定方法。同时，这些氨基酸靶向探针通常只能靶向蛋白质组中很小一部分的氨基酸，因此可靶位点的鉴定具有很大的局限性。为了实现可靶酪氨酸和赖氨酸的直接鉴定，作者合成了10对具有不同配体骨架的手性共价探针。这些探针在设计上可以分为四个主要部分：一是磺酰氟基团与邻近的酪氨酸和赖氨酸反应；二是炔基基团用于后续的靶蛋白富集和修饰位点鉴定；三是2-甲基哌嗪linker，从而在同一配体骨架探针中引入两种手性，该手性linker的引入可以有效地鉴定由特异性结合所产生的共价修饰；四是十种不同的杂环配体骨架，其中每个骨架都包含了至少一个SP3碳原子和两条可旋转的键，同时分子量在159-265Da间，具有较好的成药性。作者将这十对手性磺酰胺探针加入到活细胞中产生标记，然后利用位点特异化学蛋白质组学技术鉴定探针修饰位点，同时结合TMT定量筛选出手性特异的可靶位点。其中，作者详细优化了基于MS2的TMT定量和基于实时数据库搜索(real-time database search, RTS)的MS3定量，从而实现了1728个酪氨酸和615个赖氨酸上探针标记的定量分析。更重要的是，作者发现了513个酪氨酸和121个赖氨酸上具有手性依赖的探针标记选择性，这些位点被作者认为是可靶氨基酸位点。其中绝大部分位点都是传统靶向探针无法标记到的氨基酸位点，因此这些可靶位点都是传统竞争性策略无法鉴定的。
磺酰胺探针所鉴定的可靶新位点包含了蛋白质组中很多不同的功能位点，包括翻译后修饰酶的酶活中心，蛋白-蛋白相互作用界面，RNA结合结构域，以及药物别构调节位点等。作者进一步挑选了六个可靶向的新位点进行生化验证，其中ADP-核糖基化修饰酶PARP1的第889位酪氨酸被(R)-9-SF探针特异性靶向，同时具有较高的骨架选择性和手性选择性。作者发现突变Y889后可以显著降低(R)-9-SF在PARP1上的标记，表明这是主要的修饰位点。另外，(R)-9-SF可以有效地检测到已知PARP1抑制剂在PARP1催化口袋中的结合，因此(R)-9-SF可以成为PARP1共价探针用于其抑制剂筛选。除此之外，作者还验证了特定探针在LCMT1, ABR, WDR82等蛋白上的选择性标记。作者进一步选择了两个新可靶位点进行深入研究。第一个例子是WDR5，它具有一个可以与致癌蛋白c-MYC相互作用的结构域，并基于此调控肿瘤中的基因表达。靶向WDR5上的MYC结合位点成为了治疗MYC诱导癌症的一个潜在策略，而本文章发现位于WDR5中MYC结合位点的第228位酪氨酸可以非常特异地被(R)-2-SF修饰。作者进一步解析了WDR5和(R)-2-SF的共晶结构，发现(R)-2-SF的共价修饰很好地占据了MYC肽段的结合位点，而Co-IP实验也证明(R)-2-SF可以有效抑制WDR5和MYC间的相互作用。
作者进一步研究了另一个新靶点APMAP，这个蛋白最近被报道参与到肿瘤免疫治疗中。斯坦福大学的Bassik实验室在癌症细胞中进行CRISPR筛选，发现敲除APMAP后可以使巨噬细胞重拾对癌细胞的吞噬作用，表明APMAP是癌细胞表面一个新的“别吃我”信号。然而APMAP这个蛋白的生物功能，结构信息都十分匮乏，因此目前还没有APMAP的小分子抑制剂。作者的组学分析发现(R)-1-SF可以共价修饰在APMAP的第387位酪氨酸上，突变该位点可以使(R)-1-SF的标记消失。更为重要的是，(R)-1-SF处理可以显著诱导巨噬细胞对癌细胞的吞噬，达到跟敲除APMAP类似的水平。
综上所述，本文作者发展了新型化学蛋白质组学平台，实现了活细胞中可靶酪氨酸和赖氨酸的大规模直接鉴定。该研究为针对无药可及蛋白发展新型共价小分子配体提供了丰富的数据库，为研究靶点蛋白的功能提供了新的思路。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41557-023-01281-3
文章引用：DOI: 10.1038/s41557-023-01281-3
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