氮素是功能分子的关键成分：80%的小分子药物至少含有一个氮原子。伯胺是构建仲胺、叔胺和杂环的重要中间体。考虑到其作为基本官能团的重要性，已经开发了过多的转化来将游离胺部分引入有机结构中。伯胺的经典合成通常依赖于官能团的操纵，如叠氮或腈的还原、还原。最先进的胺合成方法通常提供需要额外操作才能获得相应伯胺的N-保护或N-取代产物。最近，已经开发了几种C(sp2)−H键的伯胺化方法，包括光氧化还原催化、电化学催化、以及其他新型胺化试剂和金属催化剂的使用。然而，C(sp3)−H键的伯胺化仍然难以捉摸。已经开发了生物催化方法来选择性地引入游离胺功能，例如转氨酶，但这些都需要预氧化的底物，并且不在C−H键处引入胺。

作者选择四氢萘1a作为模型底物，在与羟胺酯2生成的类铁-硝基化合物的反应中进行测试(Fig 1A)。尽管底物1a及其类似物的C(sp2)−H伯胺化在合成化学中得到了很好的确立，苄基C(sp3)−H键的伯胺化反应仍然未知。事实上，1a和2与游离血红素的试验反应只产生C(sp2)−H伯胺化产物4a。然后用从P450_BM3衍生的一组P411变体来评估转化。这些酶在整个大肠杆菌细胞中进行了表达和筛选。为了抑制氧抑制，反应在厌氧条件下进行。名为P411-B2的变异体，先前设计用于通过磺酰基腈进行苄基C-−H胺化，经鉴定可生产所需的伯苄胺3a，总周转数(TTN)为8。还检测到C(sp2)−H伯胺化反应生成的副产物4a，其量可忽略不计(<1TTN)。这些发现提供了一个起点来检验假设，即蛋白质工程可以转移和放大假定的无保护的铁氮类化合物对C(sp3)−H一级胺化的反应性。

选择突变体P411-B2作为高效苄基C-−H伯氨酶(P411_BPA)定向进化的起始模板。为了提高苄胺3a的催化活性和对映体选择性，进行了一系列的位点饱和诱变(SSM)和筛选。参考了相关的P411变异体的晶体结构，并主要选择血红素附近和/或位于柔性环上的氨基酸进行诱变(Fig 1B)。在每一轮SSM中，构建酶文库，并用高效液相色谱(HPLC)进行筛选，以便在96孔板上以全细胞催化剂的形式形成产物。四轮SSM和筛查引入了突变G268P、V78M、L437F和T327A，导致ee增加到64%，TTN增加36倍，达到290(Fig 1C)。随后几轮引入了突变E267D和S438G，导致最终变异体P411_BPA，并进一步将ee提高到93%，TTN提高到750。在定向进化过程中，副产物4a的形成仍然可以忽略不计。值得注意的是，在分析规模的反应中，3a的高效液相色谱收率高达85%，用简单的酸−碱萃取(1 mmol反应规模)，伯胺3a的收率为61%，ee为92%。虽然生物催化过程是可扩展的，但酶对底物浓度很敏感，羟胺酯2浓度过高通常会导致产率下降。

有了P411_BPA，作者评估了烷烃的底物范围，系统地将伯基、仲基和叔基C−H键作为初级C−H胺化的目标(Fig2)。对于含有二次苄基C−H键的环状底物，环大小在4-6个成员之间具有很好的容忍性，得到伯胺3a−3c。具有不同结构和电子基团的线性底物被证明是相容的，并且提供了具有良好对映体选择性的胺3d−3l。除了二级苄基C−H键(3d−3j)之外，初级苄基C−H键(3i−3l)和叔苄基C−H键(3k)也是合适的，具有不同水平的效率和区域选择性，突出了这种酶转化的普遍性。产物3I、3J和3K表明，二级和叔基苄基C−H键上的反应比它们的一级对应键上的反应更有利。大于此处所示的底物或具有杂原子的底物的胺化通常以递减的效率发生，此类底物可能需要基于P411_BPA的进一步定向进化。

在实现了苄基C−H键的一级胺化后，接下来询问这些酶是否可以胺化其他类型的C(sp3)−H键，特别是在存在敏感烯烃的情况下。在羟胺衍生物作为氮源和小分子催化剂的情况下，烯烃底物被报道进行了烯烃功能化。正如预期的那样，在模型底物5a与羟胺2以游离血红素为催化剂的反应中，只观察到氨基醇7a。然而，酶在生化过程中通常具有化学选择性，可以通过蛋白质工程进行调节。因此，作者设想，对P411_BPA相关酶进行适当的工程将能够选择性地使烯丙基C−H键功能化，同时将不希望发生的烯烃副反应降至最低。筛选显示，P411_BPA相关变异体具有所需的烯丙基C−H伯胺化活性(Fig 3A)。副产物7a仅在微量中形成，没有观察到C(sp2)−H伯胺化产生的苯胺。从中间变异体P411_BPA出发，从P411-B2的5个突变出发，进行了两轮SSM和筛选，产生了带有另外两个突变(N395R、S438A)的烯丙基C−H伯氨酸酶(P411_APA)。P411_APA具有极高的效率和选择性(3930TTN，93%的HPLC收率和94%的ee)，并且酶过程易于扩展，75%的分离收率(1.0 mmol反应规模)。

P411_APA能够使初级、次级和三烯丙基C-−H键功能化，底物范围宽(Fig 3B)。对于含次烯丙基C−H键的苯乙烯类底物，具有不同取代基的苯基具有很好的耐受性，可以得到活性和对映选择性都很好的烯丙基胺6a−6g。在初级苄基C-H键存在的情况下，烯丙基C-H键被官能化，具有完全的区域选择性（6e-6g）。具有噻吩(6h)和较长脂肪族取代基(6i)等杂环取代基的底物也被证明是合适的。单一的区域异构体6J是唯一的，表明P411_APA可以区分高度相似的次烯丙基C−H键。叔和伯烯丙基C-H键也可以有效胺化，得到产物6k和6l。值得注意的是，烯烃部分上的芳香基团不是烯丙基C−H胺化活性所必需的，并成功地合成了产物6M−6P。对于具有不同类型反应性C−H键的底物，P411_APA表现出很高的区域选择性。当2-己烯给出混合的区域异构体(6n)时，对于其他烯烃，观察到单一的区域异构体，最多有四对烯丙基C−H键(3o，3p)，如α-松油烯。虽然次级和初级C−H键之间的区域选择性取决于底物模式(6n，6p)，但P411_APA在较弱的三级C−H键(6o，6p)上独占地功能化了初级C−H键，这与P411_BPA的区域选择性相反(3k)。与P411_BPA类似，P411_APA的进一步定向进化可能需要末端或更大的烯烃底物的有效功能化，特别是复杂的天然产物。

总之，作者已经设计了C(sp3)−H伯胺酶，它们构成了在苄基和烯丙基位置选择性地进行伯胺化、仲胺化和叔胺化的通用平台。这些实验室进化的酶为获得具有高化学选择性、区域选择性和对映体选择性的脂肪族伯胺提供了新的途径。考虑到伯胺在生物世界中的基础作用，以及羟胺衍生物的自然存在和生物相容性，作者预计这些新的、完全基因编码的酶将提供一个起点，以扩大甚至重构目前绘制的氮代谢图。事实上，这种活动在自然界中可能已经存在，其巨大的催化能力只进行了部分探索。进一步阐明催化机理和关键中间体的表征，对于推广这一过程并启发相应小分子催化剂的设计具有重要意义。

参考文献

Jia, Z. J., Gao, S., & Arnold, F. H. (2020). Enzymatic Primary Amination of Benzylic and Allylic C (sp 3)–H Bonds. Journal of the American Chemical Society.