许多天然产物和药物都是手性含氧化合物，它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。C–H键氧化官能团化则提供了一种不同的策略来获取这些分子，表现出更高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的（sp³）C–H键氧化反应面临着：1）高键能带来的反应活性问题；2）分子中多个化学环境类似的C–H键所引起的化学、区域、立体选择性问题；3)多样化官能团与反应条件兼容性的问题。因此，羧酸的高度选择性氧化在化学上非常具有挑战性。化学策略通常依赖于分子内不同C–H键之间的反应差异或预先引入的导向基团来实现选择性，然而该策略不适用于链状脂肪酸。生物催化（酶）则采用了截然不同的策略：酶进化出底物结合通道，并将底物特定位点固定于反应中心，从而实现较好的区域和立体选择性控制。不过受到结合口袋特异性的影响，酶催化的底物适用范围极其狭窄。此外，脂肪酸羟基化酶普遍存在区域选择性差的问题。为此，扬州大学生物科学与技术学院王喜庆课题组与安徽大学生命科学学院何超课题组通过定向进化改造了P450酶(P450_BSβ)，成功实现了未活化的羧酸C–H键的高度区域和对映选择性羟基化反应。

为拓宽底物范围，作者选择催化效率低的辛酸为底物对P450_BSβ酶进行定向进化，筛选到了高转化率和高β位选择性的P450_BSβ-L78I/Q85H/G290I/突变体。该突变体将底物转化率从15%提高至90%，β位羟基化选择性由33%提高至86%。

为探究该突变体酶的合成价值，作者对该酶进行了0.5 mmol制备级反应的底物研究，发现该酶摆脱了对烃链长度的依赖，能够催化C6–C20链长的脂肪酸，同时具有很好的官能团耐受性，展现了优越的反应活性以及高度的区域和对映选择性。

为了进一步阐述该突变体蛋白的反应活性和选择性，作者解析了它与棕榈酸复合物的晶体结构。与野生型蛋白相比，三个氨基酸残基的改变使1）Cβ较Cα更加靠近活性中心；2）β位的pro(R)-H离Fe-O中心较pro(S)-H更近；3）突变体蛋白的反应腔小，更有利于催化短链的羧酸底物。因此该酶在实现高区域和对映选择性的同时，针对短链羧酸的反应活性得到了大大的提高。

综上所述，团队对P450_BSβ蛋白进行了定向进化改造，并成功应用于各种羧酸β位未活化C–H键的羟基化反应，取得了很好的反应活性、区域和对映选择性以及官能团耐受性。晶体结构分析从机理上阐明了氨基酸残基突变对反应活性和选择性的影响。该工作展现了生物催化在解决化学上具有挑战性的反应中的潜能。