DOI: 10.1016/S1872-2067(21)63798-1近日，《催化学报》在线发表了清华大学戈钧教授团队在生物催化领域的最新述评（Account）文章。该工作综述了该课题组近年来在酶–无机纳米晶体复合催化剂原位合成新方法以及构效关系方面的研究成果。论文第一作者为：曹宇飞博士，论文通讯作者为：戈钧教授。
工业生物催化面临两大重要挑战，一是可工业应用的酶催化反应类型仍然比较有限，需要拓展酶催化的反应类型；二是酶在工业反应条件下尤其在高温、有机溶剂、不适宜的pH等环境下稳定性较差，需要提高工业酶催化剂的稳定性。针对这些挑战，研究者已经开发了很多有效的方法，例如酶的定向进化、定点突变、酶的计算机从头设计和构建人工金属酶等。该文系统介绍了戈钧教授课题组开发的酶复合催化剂原位合成方法，以及该方法应用于拓展酶催化适用范围和提高工业酶催化稳定性，并且对这一领域的关键挑战和未来研究方向进行了讨论，期望为解决工业生物催化的上述难题提供新思路。
1. 总结了酶复合催化剂原位合成方法，分析了酶–无机纳米晶体复合催化剂的特点和优势。2. 介绍了利用无机晶体材料包埋酶分子以提高其稳定性的策略和影响机制，及其在多酶级联催化中的应用。3. 介绍了如何在无机晶体载体材料中构建缺陷，以此强化底物传质，提高无机晶体包埋酶的表观活性。4. 介绍了酶–金属无机纳米晶复合催化剂的原位合成和催化作用机制，以及酶–金属级联反应在手性化合物合成中的应用。(A) Single enzyme molecules are encapsulated in nanogels by surface acryloylation of a protein molecule followed by aqueous in situ polymerization. (B) Based on the analysis of enzyme sequences and the characteristic chemical patterns on enzyme surfaces, four-monomer random heteropolymers to mimic intrinsically disordered proteins are designed for enzyme solubilization and stabilization in nonnative environments. (C) Enzyme molecules are directly embedded in inorganic crystals by a coprecipitation method. (D) In situ generation of Pd nanoparticles/clusters in a confined environment of a single lipase-polymer conjugate.为了使得酶在苛刻的工业生产环境下仍然具有良好的催化性能，通过原位包埋给酶分子“穿上”一层“铠甲”是一种简单、高效的方法。其中酶和包埋材料的界面相容性是需要考虑的关键科学问题。已有多种原位合成方法可以实现上述目的，如利用原位聚合将酶分子包埋在纳米凝胶中，针对酶分子的表面性质理性设计高分子对其进行包埋，以及本课题组开发的共沉淀方法利用无机晶体对酶进行包埋。采用相同的原位合成方法，还可构建酶–金属纳米颗粒复合催化剂，实现酶催化和金属催化的高效耦合。
图2. 酶–无机晶体复合催化剂的原位合成、酶活性影响机制以及在多酶级联催化中的应用。(A) Scanning electron microscopy (SEM) images of calcinated Cyt c@ZIF-8. (B) The relative peroxidase activities of Cyt c, Cyt c@ZIF-8 composite, PVP/Cyt c mixture, Cyt c/zinc ion mixture, Cyt c/2-methylimidazole mixture, and Cyt c/ZIF-8 mixture. (C) NU-1000 encapsulation changes the coordination of the Cyt c heme active site. Probability distributions, P(D), of the N (His 18), S (Met 80), and C (Pro 30) distances relative to Fe in bulk. (D) Corresponding probability distributions inside MOF NU-1000. (E) The configurations of Cyt c in water. (F) The configurations of Cyt c inside MOF NU-1000. (G) Schematic illustration of the enzymatic cascade catalyzed by GOx/HRP@ZIF-8. (H) The relative overall activity of the enzyme cascade catalyzed by GOx/HRP_dx@ZIF-8 (x = 23, 17, 15, 13, 11, 10) without CAT or (I) with CAT. (J) Reaction kinetics (number of products, np, versus simulation time) of different radii of enzyme clusters, r = 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11(σ) without intermediate decay or (K) with intermediate decay.使用共沉淀方法原位合成酶–无机晶体复合物可以实现不同孔径大小的载体对酶的包埋，具有高效性和普适性。包埋不仅显著提高了酶的稳定性，部分酶出现了活性比天然酶更高的现象。结合多种表征手段和计算模拟对此现象进行了深入分析，对于酶复合催化剂的理性设计具有重要意义。本课题组通过理论计算和实验相结合，深入分析了多酶在无机晶体限域空间中的催化动力学和底物通道效应，阐述了包埋后酶具有高稳定性和良好的级联催化效率的关键机制。
图3. 酶–缺陷晶体复合催化剂的合成、表征、以及酶催化性能研究。(A) Cryo-electron tomography (Cryo-ET) reconstruction and magnified image of a single GOx-aZIF composite. (B) Structure of aZIF by molecular simulations (insets: schemes showing coordination). (C) Density functional theory (DFT) pore size distribution of ZIF-8, amorphous ZIF, and GOx-incorporated amorphous ZIF. (D) X-ray total scattering data and synchrotron radiation X-ray pair distribution function (PDF) of aZIF and ZIF-8. (E) Enzymatic activities of enzyme-ZIF-8 and enzyme-incorporated amorphous ZIFs, including GOx, Candida antarctica lipase B (CALB) and catalase (CAT). (F) Thermal stability of free native HRP and HRP-MOF composites at 60 and 70 °C, respectively.一般情况下使用载体对酶进行包埋会导致酶活性的下降，主要原因之一是载体中底物传质速率下降。例如将脂肪酶、辣根过氧化物酶、过氧化氢酶等包埋在ZIF-8中的活性仅为天然酶活性的10%左右。本课题组通过在MOFs中引入缺陷来解决这一问题。通过改变金属离子和配体的浓度，可以合成酶–无定形MOFs复合物。通过冷冻电镜、分子动力学计算等多种手段确认了无定形MOFs的形成。酶–无定形MOFs复合物中，大量3-6 nm的贯穿介孔有利于底物传质，酶催化剂的表观活性比晶态材料包埋的情况提高了5~20倍，接近于天然酶的活性。图4. 酶–金属复合催化剂的原位合成、尺寸效应以及酶催化和金属催化的高效耦合。(A) Structure of the CALB-Pluronic conjugate with a Pd cluster and principles of DKR of amines catalyzed by CALB and Pd cluster. (B) Structure of the CALB-Pluronic conjugate in benzene. (C) Enzyme activities of Pd/CALB-P hybrid catalyst assayed by ester hydrolysis. (D) Fluorescence spectra of CALB, CALB-P conjugates and xPd/CALB-P hybrid catalysts (x = 0.8, 1.6, 2.2 and 2.5). (E) Free-energy profiles for (S)-1-PEA racemization on pristine Pd(111) and partially oxidized Pd(111) surfaces. (F) Catalytic performance of 0.8Pd/CALB-P at 55 °C and of a combination of commercially available Novozym 435 and Pd/C at 70 and 55 °C for the DKR reactions. (G) Conversions and ee values in ten cycles of the reaction using 0.8Pd/CALB-P as the catalyst.酶催化和金属催化的耦合是拓展酶催化应用、实现酶催化和现代化学工业过程相融合的重要方式。然而，二者通常不相容并且反应条件不匹配，简单运用于一锅催化过程易造成酶和金属催化剂的失活。因此如何构建酶–金属复合催化剂，实现二者的高效耦合催化是关键挑战。本课题组利用酶–高分子结合物的限域结构，在其中原位还原合成了金属亚纳米颗粒，构建了酶–金属亚纳米颗粒复合催化剂。在该复合催化剂中高分子起到了控制金属颗粒粒径、调控酶分子和金属颗粒界面相容性、以及实现复合催化剂重复使用的作用。合成的不同尺寸的金属纳米颗粒表现出明显的尺寸效应，活性随着粒径的减小而增强。理论计算发现金属颗粒和蛋白结合物分子间配位结构是金属催化活性提高的关键。酶–无机纳米晶复合催化剂的原位合成是拓展生物催化应用的新方法。虽然这一领域已有许多努力，但仍有重要挑战有待解决。需要深入理解酶和无机材料相互作用的构效关系，深入探索在原位合成过程中酶如何参与了复合催化剂特殊结构的形成，深入阐述酶分子与无机纳米晶之间的相互作用如何调控酶的活性和稳定性，这些是理性设计酶复合催化剂的关键。此外，用于酶–金属耦合催化的酶–金属复合催化剂的通用性有待进一步研究，酶与金属颗粒的相互作用对酶催化和金属催化的活性和选择性的影响机制还需要进一步探讨。戈钧，清华大学化学工程系长聘教授，博士生导师。分别于 2004 年，2009 年在清华大学化学工程系获得本科和博士学位，2009 年至2012 年在斯坦福大学化学系进行博士后研究，2012 年开始在清华大学化学工程系工作。主要从事生物化工、酶催化剂工程研究。研究工作获得国家优秀青年科学基金，“长江学者奖励计划”（青年），北京市杰出青年基金项目，国家重点研发计划青年项目，863 生物医药领域青年科学家专题等资助。获得 MIT Technology Review World 35 Innovators Under 35，“闵恩泽能源化工奖”青年进步奖。近年来代表成果发表于Nature Catalysis，Nature Nanotechnology，Nature Communications， Science Advances，Trends in Biotechnology等期刊。https://www.chemeng.tsinghua.edu.cn/info/1094/2409.htmYufei Cao, Jun Ge *, Chin. J. Catal., 2021, 42: 1625–1633
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