东京大学NC | 构建最小lactazole支架-FIT系统在硫肽体外工程化中的应用

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内容

01 lactazole生物合成的体外重组
合成lactazole A的 BGC只编码大环形成所必需的五个酶LazBLazCLazDLazELazF),预测LazD含有LP结合所必需的RiPPs识别元件;而LazE包含一个ATP结合结构域,用于CPCys/Ser残基的ATP依赖的环脱水(Fig. 1d);LazF是由单核苷酸依赖的脱氢酶和谷氨酸消除结构域融合形成的双功能蛋白研究者假设唑的形成是lactazole生物合成的起点,并试图重获LazDEFLazDLazELazF)的活性。研究者首先在E.coli BL21DE3)中表达五个酶FIT系统用于产生前导肽(Fig. 1a。发现LazDLazE单独没有活性。相反,将LazALazDEF孵育可以得到含有四个唑的单一产物(Fig.1d)。

Fig. 1 a Primary amino acidsequence of LazA precursor peptide.b–g Reconstitution of azole and Dha formation in FIT-Laz.


接下来,研究者试图重建Dha(此途径的整个核糖体翻译后修饰过程(PTM)会形成脱氢丙氨酸(Dha)或唑)形成活性Fig.1d)。LazBF是一种裂解脱水酶,在硫肽BGCs中广泛存在。在laz BGC中,LazB为谷氨酰化结构域,LazFN端部分为消除结构域。研究者首先尝试在未修饰的LazA上测试LazB的活性。结果表明,LazB利用带GlutRNAGlu催化LazA的谷氨酰化LazBF可以催化LaZA中部分Dha的形成,且不依赖于唑的形成。LazALazBDEFtRNAGluGluRS共孵育形成具有相同主要产物的复杂混合物。吡啶合成酶LazC可引发[4+2]-环加成反应形成含脱氢哌啶的大环产物。LazA与全酶组(LazBCDEFtRNAGluGluRS)共孵育时会形成lactazole ALP-NH2,并伴有微量的其它产物,表明一锅反应真实产生了硫肽。这证明用FIT系统获得的LazA的翻译产物可以用全套Laz酶处理产生lactazole A,故称之为FIT-Laz系统。

Fig. 1 h–k Reconstitutionof lactazole A biosynthesis in FIT-Laz.


02 Laz酶的底物耐受性分析
为了了解laz BGC的整体底物可塑性,研究人员检测了FIT-Laz系统能否产生lactazole类似物。从Ala扫描突变开始,在LazACP区制备了14个单点Ala突变体。只有4Ala突变体(S1AS10AS11AS12A)阻断了硫肽的形成,而其他结构则促使相应的lactazole类似物和LP-NH2的形成(Fig.2a)。另一方面,C13A突变体在尾部区域形成未修饰的硫肽。在LazAS4-C7ASer1Ser10Ser11Ser12Cys13)上经历PTM的五个残基是有效成熟所必需的。将所得的硫肽称为最小的lactazole支架,相应的前导肽为lactazole的最小前体LazAmin

Fig. 2 a Ala scanning ofthe LazA CP.b LC-MS chromatograms as ina for the enzymatic processing of LazAmin on the left with azoomed-in mass spectrum of the produced thiopeptide on the right.


研究者检测了Laz酶对CP中带电氨基酸的耐受性,并对LazAmin CP进行了LysGlu扫描。在LazAmin的非必要位置制备了11个单点Lys突变体和11个单点Glu突变体,并分析了它们的加工过程。总体而言,Glu的接受度低于Lys。除了五个已经鉴定的氨基酸外,Trp2Ala14LazAmin的成熟过程中也起着重要的作用。接下来,研究者试图建立使用FIT-Laz可接受的最小和最大环。结果表明,可有效形成29-23元硫肽。4-6个氨基酸缺失突变体也是有活性的底物,产生20-14元环,但由于积累了大量部分加工的线性多肽,总活性相对较低。


Fig. 2 c LC-MSchromatograms as in a for ring expansion and contraction study of LazAmin.


因此,Laz酶可获得的最小的硫肽为14元环,比以前最小的thiocillin变体小9个原子。最大的合成产物带有一个62元大环,相当于插入了10个氨基酸。整体加工效率随着环大小的增加而线性下降,其中LazAmin本身可以有效的转化为一个大环和 LP-NH2,插入多个氨基酸的底物会积累大量线性中间体和副产物。FIT-Laz可以在大环内适应序列随机化。将大环内序列随机化与C-端延伸相结合,构建了一个长34个氨基酸的LazAmin突变体。尽管它很大,但当用Laz酶处理时,这个底物产生了3.7kDa的硫肽(Fig. 3),突出了LazAmin中关键残基的支架能力。这些数据表明laz BGC具有非典型的可伸缩性。

Fig. 3 Synthesis oflactazole-like thiopeptides with randomized sequences.

03 FIT-Laz杂化硫肽的合成
FIT系统的一个优点是它对遗传密码重新编程的适应性。可以通过向缺乏某些蛋白质氨基酸和同源氨酰-tRNA合成酶的翻译混合物中添加用弹性酶预选npAAs的正交tRNA,从而实现多个npAA的掺入。研究者首先测试了FIT-Laz产生N-甲基化硫肽的能力,并制备了12个在CP中含有单一Met密码子(AUG)的lazAmin突变体。所测试的N-甲基化氨基酸中的任何一个在9个位置都很容易被接受,而Trp2Cys13Ala14处的突变是有害的,几乎没有成熟的硫肽产生。接下来,研究者证实了可以按照同样的逻辑将更多种类的npAAs引入到硫肽支架中,得到含有各种npAAs的杂化硫肽(Fig. 4a)。


Fig. 4 Synthesis of hybrid thiopeptides by genetic code reprogramming with the FIT-Laz system. 


最后,研究者证实可以将多种不同的npAAs同时结合到最小的lactazole支架中,以生成高度人工的大环。经过一些实验,选择对四个密码子(AAGCAUUGGUUU)重新编程,并将它们分别重新分配为MeGlycLeuPhe(F5)MeAla。为此,编码具有四个密码子的LazAminDNA模板(Fig. 4b,c)在Lys/His/Phe/Trp耗尽的翻译反应中与MeGly-tRNACUUMeAla-tRNAAAAcLeu-tRNAGUGPhe(F5)-tRNACCA孵育,以产生含有四个npAAsLazA前导肽。用LazBDEF/tRNAGlu/GluRS处理该底物得到了含有两个唑和三个Dha的完全加工的线性前体,而利用全酶组的反应产生了预测的硫肽,并伴随着LP-NH2Fig. 4d)。


Fig. 5: Summary of the work.


综上,本研究建立的FIT-Laz系统可作为快速探测lactazole 生物合成的原型工具,整个工作流程可在两个工作日内完成从lazA DNA模板的PCR组装到反应结果的LC-MS分析(Fig.5)FIT-Laz系统与强大的体外筛选技术的集成将促使发现具有重新设计的生物活性的人工硫肽。基于最小lactazole支架的化合物可以打开一个未探索的硫肽化学空间,其具有理想的药理活性,可用于药物发现。


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