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Fig. 1 a Primary amino acidsequence of LazA precursor peptide.b–g Reconstitution of azole and Dha formation in FIT-Laz.
接下来,研究者试图重建Dha(此途径的整个核糖体翻译后修饰过程(PTM)会形成脱氢丙氨酸(Dha)或唑)形成活性(Fig.1d)。LazBF是一种裂解脱水酶,在硫肽BGCs中广泛存在。在laz BGC中,LazB为谷氨酰化结构域,LazF的N端部分为消除结构域。研究者首先尝试在未修饰的LazA上测试LazB的活性。结果表明,LazB利用带Glu的tRNAGlu催化LazA的谷氨酰化。LazBF可以催化LaZA中部分Dha的形成,且不依赖于唑的形成。LazA与LazBDEF、tRNAGlu和GluRS共孵育形成具有相同主要产物的复杂混合物。吡啶合成酶LazC可引发[4+2]-环加成反应,形成含脱氢哌啶的大环产物。LazA与全酶组(LazBCDEF、tRNAGlu和GluRS)共孵育时会形成lactazole A和LP-NH2,并伴有微量的其它产物,表明一锅反应真实产生了硫肽。这证明用FIT系统获得的LazA的翻译产物可以用全套Laz酶处理产生lactazole A,故称之为FIT-Laz系统。
Fig. 1 h–k Reconstitutionof lactazole A biosynthesis in FIT-Laz.
Fig. 2 a Ala scanning ofthe LazA CP.b LC-MS chromatograms as ina for the enzymatic processing of LazAmin on the left with azoomed-in mass spectrum of the produced thiopeptide on the right.
研究者检测了Laz酶对CP中带电氨基酸的耐受性,并对LazAmin CP进行了Lys和Glu扫描。在LazAmin的非必要位置制备了11个单点Lys突变体和11个单点Glu突变体,并分析了它们的加工过程。总体而言,Glu的接受度低于Lys。除了五个已经鉴定的氨基酸外,Trp2和Ala14在LazAmin的成熟过程中也起着重要的作用。接下来,研究者试图建立使用FIT-Laz可接受的最小和最大环。结果表明,可有效形成29-23元硫肽。4-6个氨基酸缺失突变体也是有活性的底物,产生20-14元环,但由于积累了大量部分加工的线性多肽,总活性相对较低。
Fig. 2 c LC-MSchromatograms as in a for ring expansion and contraction study of LazAmin.
Fig. 4 Synthesis of hybrid thiopeptides by genetic code reprogramming with the FIT-Laz system.
最后,研究者证实可以将多种不同的npAAs同时结合到最小的lactazole支架中,以生成高度人工的大环。经过一些实验,选择对四个密码子(AAG、CAU、UGG和UUU)重新编程,并将它们分别重新分配为MeGly、cLeu、Phe(F5)和MeAla。为此,编码具有四个密码子的LazAmin的DNA模板(Fig. 4b,c)在Lys/His/Phe/Trp耗尽的翻译反应中与MeGly-tRNACUU、MeAla-tRNAAAA、cLeu-tRNAGUG和Phe(F5)-tRNACCA孵育,以产生含有四个npAAs的LazA前导肽。用LazBDEF/tRNAGlu/GluRS处理该底物得到了含有两个唑和三个Dha的完全加工的线性前体,而利用全酶组的反应产生了预测的硫肽,并伴随着LP-NH2(Fig. 4d)。
Fig. 5: Summary of the work.
综上,本研究建立的FIT-Laz系统可作为快速探测lactazole 生物合成的原型工具,整个工作流程可在两个工作日内完成从lazA DNA模板的PCR组装到反应结果的LC-MS分析(Fig.5)。FIT-Laz系统与强大的体外筛选技术的集成将促使发现具有重新设计的生物活性的人工硫肽。基于最小lactazole支架的化合物可以打开一个未探索的硫肽化学空间,其具有理想的药理活性,可用于药物发现。
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