DNAzyme是一种具有酶促作用的DNA分子，可以催化RNA裂解等化学反应。由于其序列的可编程性、易于合成和化学稳定性，被广泛用于构建基于DNA的传感器、诊断工具和分子机器的功能组件。特别是，能够响应外部刺激调节活性的DNAzyme，因其广泛的应用而日益受到重视。

成果简介

近日，东京大学Mitsuhiko Shionoya教授课题组在《Angew. Chem. Int. Ed.》上发表了题为“Sharp Switching of DNAzyme Activity through the Formation of a Cu(II)-mediated Carboxyimidazole Base Pair”的研究论文。文中，作者通过将一种Cu(Ⅱ)介导的羧基咪唑碱基对（Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c，最稳定的人造金属-碱基对之一）加入到一种已知的切割RNA的DNAzyme中，构建了一种Cu(Ⅱ)响应的DNAzyme，该DNAzyme对底物的切割作用在无Cu(Ⅱ)时受到抑制，在Cu(Ⅱ)存在时得到高效率的激活，这是由于Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c的配对可以诱导催化活性结构激活，因此该DNAzyme的活性在反应过程中可以通过Cu(Ⅱ)的添加、去除和还原发生转变从而实现对Cu(Ⅱ)的响应。

图文解读

示意图1. Cu(Ⅱ)响应的DNAzyme的基本设计。a) split Cu(Ⅱ)响应的RNA-切割的DNAzyme通过在茎部区域形成Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c碱基对活性激活的示意图。b) Cu(Ⅱ)响应的DNAzyme（Im^c-DNAzyme）的序列设计。4-羧基咪唑核苷酸和Cu(Ⅱ)介导的碱基对（Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c）的化学结构如图所示。底物中的“rA”表示切割位点处的腺嘌呤核糖核苷酸。

图1. a) 在Cu(Ⅱ)存在的情况下含有一个Im^c-Im^c碱基对的DNA duplex 1·2的熔解曲线。Duplex 1·2：(5′-CAC ATT A Im^C T GTT GTA-3′)·(3′-GTG TAA T Im^C A CAA CAT-5′)。[Duplex]=2.0 μM，在10 mM HEPES 缓冲溶液中（pH=7.0）[Cu^II]/[duplex]=0，1，2，3，100 mM NaCl，0.2 °C min^–1。所有样品在测量前都进行了退火。b) 含有一个Im^c-Im^c碱基对的DNA duplex 1·2和含有一个H–H碱基对（羟基吡啶酮碱基对）的DNA duplex的溶解温度对比。误差条表示标准误差。说明了Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c碱基对可以在中性条件下形成。

图2. a) 在没有Cu(Ⅱ)和存在1当量Cu(Ⅱ)时Im^C-DNAzyme和原始的E5 DNAzyme的RNA切割活性，BG为背景。[DNAzyme]=1.0 μM，[底物]=10 μM，在10 mM HEPES中（pH=7.0）[CuSO₄]=1.0 μM (1当量)，1 M NaCl，10 mM MgCl₂，25 °C，N=3。b) DNAzyme催化的RNA裂解反应的表观一阶速率常数(k_obs)，开关比也显示在了图中，其中以H-DNAzyme的k_obs值来作为对比。误差条表示标准误差。说明Im^C-DNAzyme和原始的E5 DNAzyme相比有对Cu(Ⅱ)的开关响应，同时和H-DNAzyme相比开关比明显更高，这很有可能是因为在没有Cu(Ⅱ)的情况下，带负电荷的Im^C碱基之间的产生的排斥力会导致DNAzyme结构的不稳定。这些结果都表明响应Cu(Ⅱ)调节DNAzyme活性必须要形成Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c碱基对。

图3. Im^C-DNAzyme依赖于Cu(Ⅱ)的RNA-切割活性调控。a) 加入Cu(Ⅱ)激活Im^C-DNAzyme的活性。[Cu^II]/[DNAzyme]=1.0。b) 加入Cu(Ⅱ)结合三肽（GHK）去除Cu(Ⅱ)使得DNAzyme失活。[GHK]/[DNAzyme]=1.0或2.0。c) 加入抗坏血酸盐（Asc）还原Cu(Ⅱ)使得DNAzyme失活。[Asc]/[DNAzyme]=10。d) 通过迭代加入Cu(Ⅱ)（1当量），GHK（2当量），Cu(Ⅱ)（2当量）和GHK（4当量）来迭代切换DNAzyme的活性。[DNAzyme]=1.0 μM，[substrate]=10 μM，25 °C。N=3。Im^C-DNAzyme的活性在Cu(Ⅱ)存在时显示为红色实线，在Cu(Ⅱ)不存在时显示为红色虚线。误差条表示标准误差。

图4. Im^C-DNAzyme的金属选择性。[DNAzyme]=1.0 μM，[底物]=1.0 μM，[金属离子]=1.0 μM 1当量），25 °C，3 h。N=3。对于Hg^II和Ag^I离子实验，反应缓冲液中的氯被硝酸盐取代。b) Cu(Ⅱ)响应的Im^C-DNAzyme和Hg^II响应的T-DNAzyme的依赖金属离子的正交激活。将Cu(Ⅱ)（1当量）和/或Hg^II离子（4当量，即每T-T碱基对1当量）添加到Im^C-DNAzyme和T-DNAzyme的混合物中。误差条表示标准误差。这种依赖于金属的正交调节将被应用于开发基于DNA的逻辑门和计算电路。

总结与展望

本文通过结合Cu(Ⅱ)介导的羧基咪唑碱基对（Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c），开发了一个Cu(Ⅱ)响应的DNAzyme。切割RNA的亲代DNAzyme被分开成两半，当Cu(Ⅱ)不存在时，由于其中的Im^C配体带负电荷相互排斥，DNAzyme无活性，当Cu(Ⅱ)存在时，Im^c-Cu^Ⅱ-Im^c碱基对形成诱导DNAzyme活性的激活，该Cu(Ⅱ)响应的DNAzyme显示出很高的开关比（12倍）。作者认为目前的设计策略有望应用于进一步开发各种金属响应的DNA器件和基于DNA的分子机器。

作者简介

Mitsuhiko Shionoya，现任东京大学教授，1978年至1986年在东京大学学习，之后以助理教授身份先后任职于广岛大学和日本分子科学研究所，其后在广岛大学担任讲师和副教授职位，并于1995年晋升为日本分子科学研究所教授，自1999年起担任东京大学化学系教授。Shionoya教授主要研究领域为生物无机化学、超分子化学、配位化学和有机金属化学，基于在这些领域的杰出贡献，Shionoya教授先后获得 Inoue Prize for Science (2007); The Chemical Society of Japan Award for Creative Work (2007); University of Louis Pasteur Medal (2008); The Special Prize for Science and Technology, MEXT (2016); Japan Society of Coordination Chemistry Award (2018); Izatt-Christensen Award (2020) 等奖项。此外，自2013年起，Shionoya教授担任Chemistry Letters的主编，并于2014年入选日本内阁府学术会议成员。

https://doi.org/10.1002/anie.202009579

编辑：一杯酸奶不加糖

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