Formicamycins和fasamycins是典型的聚酮类天然产物，具有显著的抗菌活性。本文揭示fasamycins需两步途径(扩环与缩环)转化为formicamycins，涉及两个基因，forX和forY。敲除forX，只产fasamycin E，敲除forY，产生一些新的Baeyer-Villiger氧化型的内酯类中间体，说明ForX作为Baeyer-Villiger单氧化酶可使fasamycins的C环去芳构化。通过体内交叉喂养以及生物仿生半合成实验，作者发现这些内酯类产物在ForY的催化下以特殊的还原缩环反应形成formicamycins。

微生物芳香聚酮类化合物是生物合成相关分子中的大家族之一，结构多样且具有显著的生物活性，如已应用于临床的四环素类抗生素，蒽环类抗肿瘤药。其结构多样性主要通过后修饰酶引入，如酰化，烷基化，糖基化，卤化以及氧化还原，也可由氧化还原酶催化C-C键断裂，重排使结构更复杂化，如jadomycins，gilvocarcins以及chartreusins生物合成途径中的黄素依赖的Baeyer-Villiger (BV) 单氧化酶。

Fig.1 Chemical skeletons of 1-21and 2D NMR structers determination of 18.

Fig.2 Comparison of the fasamycin/formicamycin biosynthetic gene clusters.

  由以上生信分析以及实验结果指导，作者分别通过cas9介导的基因编辑同框敲除forX，forY，敲除forX，只形成fasamycin E (3, fig.3c)，这一点证实ForX在formicamycin生物合成中发挥氧化功能，并且以卤化的fasamycin为底物。敲除forY，产生6个新化合物17-22(fig.1，fig.3d)。通过与已知化合物3的ESI-MS，UV对比，以及2D NMR，确定17-21的结构。这些结果说明fasamycins转化为formicamycins需要经过由ForX催化fasamycin类底物进行Baeyer-Villiger反应的扩环和ForY催化Baeyer-Villiger中间体进行两电子还原以及C19位氢化物加成的缩环反应。为了证实以上结论，作者试图体外表达上述两个蛋白，很不幸未能获得可溶性蛋白，因此进行仿生化学合成法研究生物合成途径，向敲除forX的S. formicae 培养液中添加化合物18，9天后产生formicamycin同源物5，8，9，13，19，这一点与18是formicamycins的直接中间体以及ForY的潜在底物相一致。

Fig. 3 Mutational analysis of the tailoring enzyme encoding genes involved in formiacamycin biosynthesis. (a) S. formicae wild type; (b) S. formicae▲forV; (c)S. formicae ▲forX; (d)S. formicae ▲forY.

为了模仿ForY催化的生物合成转化，作者使用硼氢化钠还原化合物19（fig.4），得到4个化合物(23-26)，其中23和24是两对具有formicamycin环结构的（10RS, 19RS）非对映异构体，UPLC分析(fig.5)得出二者的非对映过量值分别为41.3%和40.5%；25是C10-C19位双键还原的内酯，没有发生通过缩环进行的重排；NMR, MS显示26为C11位脱氧化的19。

对于芳环系统脱芳构化在天然产物中已有报道，如缺失agnestins和cryptosporioptides中可能编码Baeyer-Villiger酶的基因，会有芳香前体的富集。对于ForX的Baeyer-Villiger活性，作者认为可能存在两种途径（fig.6）。在第一种途径中，过氧黄素作为亲电试剂将氧引入到C10位形成叔羟基，然后对相邻苯酚去质子化。随后随着键迁移以及C20位质子化发生重排。在第二种途径中，ForX可能通过底物结合首先诱导环C自发互变异构，随后将过氧黄素中的质子转移到C9羰基上产生氧鎓中间体，然后黄素过氧阴离子随后在经典BV-样反应中作为亲核试剂产生内酯中间体。作者认为途径I更适合，通过次氯酸介导依赖于黄素的卤化酶将亲核氯离子转化为高反应性的亲电试剂，这一点是与ForX是Group A单氧化酶催化羟基化反应相一致。

Fig.5 UPLC-UV analysis for the reduction products 23 and 24.

作者猜测ForY随后作为黄素依赖的还原酶催化内酯中间体两电子还原，这个反应可能是氢离子通过1,4-共轭进攻C19位形成烯醇27。随后烯醇式随着C9-C10 sigma 键以及一个环氧化物中间体的形成而破坏，随后的重排可产生具有总环收缩的C10叔羟基，这一反应让人联想到 Favorskii反应。此途径与硼氢化钠还原反应形成的副产物以及C9-C10键形成过程中轨道重叠所需的立体空间相一致。Favorskii类反应在自然界中很罕见，在聚酮天然产物enterocin中曾有报道，该途径涉及通过双4-电子氧化激活前一中间体，该反应由一个黄素依赖的单氧化酶EncM催化，该酶利用黄素-N5-氧化物而非过氧黄素中间体催化底物氧化并激化 Favorskii类反应，氧化促进之后的缩醛和杂环化反应，且由EncM介导。

Fig. 6 The alternative pathways for each step of the proposed two-step ring expansion-contraction mechanism of formicamycin biosynthesis from fasamycin E.

在formicamycin生物合成途径中，只产生单一立体构型的产物而非如同过硼氢化钠反应所产生的产物，说明ForY必定既控制立体化学也限制反应协同物的产生。由ForY催化的还原环缩合在聚酮生物合成过程中非常特别，基因组分析没有搜索到类似BGC，说明该途径是formicamycin生物合成过程中特有的。后续作者将会对这一特殊的途径进行详细的研究，敬请期待！